結核分枝桿菌耐左氧氟沙星的基因檢測

結核分枝桿菌耐左氧氟沙星的基因檢測

經過2008年在全國范圍內對核電站生長率進行的藥物耐藥性調查的結果，接近1.3個結核病的患者被認為是服用抗癲癇藥物的患者，超過8.32%的患者被認為是抗癲癇藥物的患者。喹諾酮類藥物包括左氧氟沙星(LFX)具有良好的抗結核性能,在耐多藥結核的治療中起到了重要的作用,但因為無序及不規(guī)范用藥,已出現(xiàn)了大量對LFX耐藥的結核菌株。為避免無效用藥,臨床迫切需要開展LFX的耐藥性檢測。由于傳統(tǒng)的藥敏檢測方法需時較久,遠不能滿足臨床診治的需求,因此,使用新的、快速的結核分枝桿菌LFX耐藥性檢測技術顯得十分重要。本研究將基因檢測技術和顯微鏡觀察藥物敏感性檢測技術(MODS)對MTB的LFX敏感性快速診斷進行了研究分析,現(xiàn)將結果報道如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1lx耐lx菌株的篩選32株MTB臨床分離株均為本院收治的肺結核患者痰標本分離、篩選出的耐LFX菌株,其中2株單耐LFX,7株為多耐藥,23株為耐多藥;H37Rv為實驗對照用標準MTB菌株,購自國家菌種保存中心。1.1.2不同溶液配制的藥劑將左氧氟沙星藥粉(揚子江藥業(yè))配置成濃度為10mg/mL的藥液后,再將配置好的藥液無菌濾膜過濾,分裝,-20℃保存。應用時取出,常溫下溶解,配置成所需濃度。1.1.3培養(yǎng)基PNB鑒別培養(yǎng)基、TCH鑒別培養(yǎng)基、改良羅氏培養(yǎng)基、改良7H9液體培養(yǎng)基均按《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》由本院制備。1.1.4儀器PCR儀(Bio-RAD)、倒置顯微鏡、24孔細胞培養(yǎng)板(TPP上海肺科醫(yī)院引進)。1.2pcr和鑒定痰標本MTB的分離、培養(yǎng)與鑒定參照《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》。應用改良羅氏培養(yǎng)基法檢測收集的對LFX耐藥的MTB臨床分離株32株,其中對LFX低耐藥21株,對LFX高耐藥11株。酶及緩沖液、dNTP購于TAKARA公司。H37Rv和耐LFX的MTB臨床分離株DNA提取與gyrA目的片段528bp的擴增、測序。采用經典的方法提取MTB全染色體DNA作為模板,基因擴增在美國ABI2720themocyclerPCR儀器上進行,引物由上海生物工程公司合成,引物序列為P1:5′-GCGCGGCGCAGCTTTATCAC-3′(正向引物)、P2:5′-AGCACCGTCGGCTCTTGCAC-3′(反向引物)。熱循環(huán)為95℃預變性1min,然后按95℃15s,65℃15s,72℃30s,循環(huán)30個周期,再72℃延長7min后,在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測PCR產物。PCR產物純化和測序工作由上海華大基因完成,結果與標準株H37RvgyrA基因相比。MODS檢測MTB對LFX耐藥性參照文獻方法,每株待檢菌株檢測時設置兩個陰性對照孔,兩個陽性對照孔,20個含藥孔。將待檢菌株磨菌后調整濁度至1個麥氏單位,10-3稀釋,在對照孔和含藥孔內分別加入待檢菌液0.4mL,然后分別加入0.4mLLFX藥液,LFX藥物終濃度選擇實驗分別采用0.0625～12.0μg/mL系列梯度倍比稀釋。將24孔細胞培養(yǎng)板用膠帶密封,放置密封的塑料袋內,放入37℃的溫箱培養(yǎng),自孵育后第3天在倒置顯微鏡下開始觀察(×400),每天觀察1次,4～7d判斷藥敏結果,如果對照孔內觀察到索狀結構生長,加藥孔內無索狀結構生長,判定該菌株為敏感株;如加藥孔內有索狀結構生長,判定該菌株為耐藥株。每次實驗均設H37Rv為質控株。2mtb耐藥菌株鑒定2.1H37Rv測序結果與H37Rv標準圖譜一致,未見基因突變。32株耐LFX的MTB菌株測序結果顯示,32株均有21位密碼子CGA-CCA(Arg-Pro)突變及95位密碼子AGC-ACC(Ser-Thr)突變。對LFX低耐藥的21株菌株中,3株只有95位密碼子AGC-ACC(Ser-Thr)突變;2株同時有90位GCG-GTG(Ala-Va1)突變,2株同時有94位GAC-CAC(Asp-His)突變,5株同時94位GAC-AAC(Asp-Asn)突變,5株同時有94位GAC-GGC(Asp-Gly)突變,4株同時有94位GAC-GCC(Asp-Ala)突變。11株對LVF高耐藥株中,2株同時有90位GCG-GTG(Ala-Val)突變,3株同時有94位GAC-GGC(Asp-Gly)突變,2株同時有94位GAC-GCC(Asp-Ala)突變,2株同時有94位GAC-TAC(Asp-Tyr)突變,1株同時有91位TCG-CCG(Ser-Pro)突變。除外21位密碼子CGA-CCA突變及95位密碼子AGC-ACC突變考慮為正常突變,均未發(fā)現(xiàn)雙突變,見表1。2.2MODS技術檢測結果并與羅氏絕對濃度法結果進行比較,采用MODS技術檢測32株MTB菌株LFX耐藥性,其中30株在7d內均獲得藥敏結果,而羅氏藥敏4～6周才能判定結果。細胞培養(yǎng)板改良7H9液體培養(yǎng)基條件下LFX的MIC為0.25μg/mL,低耐藥設定值大于1.0μg/mL,高耐藥設定值大于4.0μg/mL,兩法藥敏結果相符31株,符合率96.9%(31/32)。不符合的1株為羅氏絕對濃度法低耐藥,而MODS技術檢測判定為敏感。3基因檢測結果由于LFX具有良好的抗結核菌活性,目前被世界衛(wèi)生組織推薦作為主要的抗結核藥物在耐藥和耐多藥結核病患者中使用。眾所周知,LFX被作為高效廣譜抗菌劑已廣泛應用于臨床多年,甚至到了濫用的程度。隨著LFX的無序及不規(guī)范使用,其對MTB的耐藥性也逐漸顯現(xiàn)出來,有資料統(tǒng)計耐多藥菌株中LFX耐藥率超過一半以上,這種現(xiàn)狀下,如何盡早獲知結核菌株對LFX耐藥的重要性和必要性不言而喻。本文選擇已獲得羅氏培養(yǎng)藥敏鑒定的耐LFX的MTB菌株作為檢測對象,利用基因檢測方法和顯微鏡觀察藥物敏感性檢測技術進行了快速檢測,并就檢測結果、方法學的優(yōu)劣及作為適宜技術推廣價值進行簡單分析?；驒z測的依據是LFX主要通過抑制DNA旋轉酶A(gyraseA)亞單位與DNA的結合,從而抑制結核菌DNA的復制與表達,達到對MTB的殺滅作用。gyrA是DNA旋轉酶A亞單位的編碼基因,它的突變導致LFX無法與DNA旋轉酶A亞單位結合,使MTB對LFX產生耐藥?；驒z測結果提示,H37Rv未發(fā)生gyrA基因突變,與H37Rv株序列的差異比較顯示,32株耐LFX臨床株21位密碼子CGA-CCA及95位密碼子AGC-ACC均發(fā)生突變,考慮為正常突變。29株耐LFX臨床株發(fā)生了有義突變,分別在第90、91和94位密碼子上,突變率為90.6%,未發(fā)現(xiàn)在同一株MTB上存在gyrA雙突變的情況。從突變點位及核酸突變模式看,未能發(fā)現(xiàn)低耐藥株和高耐藥株有明顯差異,因此不能從基因突變檢測方法來完全區(qū)別低耐藥和高耐藥。本實驗中有3株LFX耐藥株未發(fā)現(xiàn)gyrA突變,提示gyrA突變不是MTB耐氟喹諾酮類藥物惟一的機制,可能是gyrB突變、細菌對喹諾酮類通透性降低、細菌對藥物主動外排增強等,本文未進行相關檢測。MODS的依據是MTB在液體培養(yǎng)基中快速生長會有特征性索狀結構的形成,該結構較容易在顯微鏡下被觀察到。MODS技術是近幾年研究較多的一種快速診斷MTB耐藥性表型的新方法,已被證明檢測快速、成本低廉、敏感性及特異性和常規(guī)藥物敏感實驗高度一致、重復性好。本實驗利用MODS技術檢測32株MTB菌株LFX耐藥性,其中30株在7d內均獲得藥敏結果,和羅氏藥敏結果比較,時間上明顯縮短。兩種方法藥敏結果相符31株,符合率極高(96.9%),且低耐藥及高耐藥檢測結果也與羅氏藥敏結果高度一致。從方法學角度看,基因檢測及MODS技術對MTB菌株LFX耐藥性診斷都能達到快速檢測要求,且與羅氏藥敏結果符合率也較高。但就本實驗提供MTB菌株基因檢測結果看,MTB菌株LFX耐藥性還不能完全用基因突變解釋,也不能從基因突變檢測方法來完全區(qū)別低耐藥和高耐藥,且基因檢測實驗要求高,專用設備不是一般實驗室能具備的,批量檢測成本較低而單個檢測比較麻煩。MODS技術檢測MTB菌株LFX耐藥性,與羅氏藥敏結果高度一致,在時間、檢測成本方面占有絕對優(yōu)勢,能在基層實驗室推廣應用。快速、準確檢測到對LFX低耐藥MTB菌株,有利于及時更換有效的抗結核藥物,