紫杉醇微乳的制備及其藥動(dòng)學(xué)研究

紫杉醇微乳的制備及其藥動(dòng)學(xué)研究

子松醇是治療小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和乳腺癌的有效藥物。其抗癌機(jī)制是促進(jìn)微管的結(jié)合，并通過微管的雙聚體形成微管，使微管非常穩(wěn)定。最后，通過具有獨(dú)特的功能機(jī)制和精確的治療效果，紫杉醇是最具應(yīng)用價(jià)值的抗癲癇藥物之一。由于紫杉醇口服幾乎不吸收,現(xiàn)臨床應(yīng)用的紫杉醇注射液(商品名為泰素,Taxol)是以聚氧乙基代蓖麻油(cremophorEL)∶無水乙醇(50∶50)制成的無色粘稠溶液,使用時(shí)經(jīng)用氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注。紫杉醇注射液中的cremophorEL易引起過敏反應(yīng)和低血壓,極大地限制了臨床應(yīng)用,為此,近年來研究不含有cremophorEL的注射液已成為紫杉醇藥物制劑的研究熱點(diǎn)之一。微乳(microemulsion)又稱納米乳(nanoemulsion),是由油相、水相、乳化劑和助乳化劑組成的澄清或帶乳光的液體、其性質(zhì)穩(wěn)定,屬熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng),許多難溶性藥物制成微乳后具有緩釋和靶向作用。本研究選用低毒性的乳化劑和油相制備紫杉醇自微乳,并以紫杉醇注射液為對(duì)照,考察了自微乳在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及豚鼠的急性過敏反應(yīng)。儀器、試劑和儀器HP-1100型高效液相色譜系統(tǒng)由配套可見紫外檢測(cè)器、HP3395型積分儀組成(美國(guó)安捷倫公司);HypersilODS2色譜柱,250mm×4.6mm,5μm(大連依利特分析儀器有限公司);BP2D精密電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);752型可見紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);2230型電子顯微鏡(日本電子公司),激光粒度掃描儀(德國(guó))。紫杉醇原料(北京四環(huán)制藥廠,純度為98.5%);紫杉醇注射液(北京制藥廠,規(guī)格5mL∶30mg,批號(hào)20010512);地西泮(內(nèi)標(biāo),北京制藥廠,純度>98%);大豆磷脂(上海浦江磷脂有限公司,純度大于80%);無水乙醇(AR級(jí),北京化工廠生產(chǎn));三辛酸甘油酯、三丁酸甘油酯、玉米油、大豆油和PluronicF68均購(gòu)自SigmachemicalCo。Sprague-Dawley(SD)大鼠:體重(225±s25)g,雌雄各半;豚鼠:體重(275±25)g,雌雄不限,均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物室提供。實(shí)驗(yàn)方法1紫冷醇自微乳液的制備根據(jù)紫杉醇在油中的溶解度制備三角相圖,確定油、水和助乳化劑的成乳范圍,以均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化乳劑中各組分量,混勻制成自微乳。1.1溶解度的測(cè)定根據(jù)紫杉醇在油相中的溶解度選擇三辛酸甘油酯∶三丁酸甘油酯(1∶1)作混合油相,分別取玉米油、豆油、三辛酸甘油酯和三丁酸甘油酯10mL置試管中,依次加入紫杉醇適量使成過飽和溶液,置振蕩器中振蕩24h,用0.45μm濾膜過濾,取定量的油相,加流動(dòng)相稀釋10倍,進(jìn)樣20μL,測(cè)定溶解度。1.2角相圖的制備采用對(duì)紫杉醇溶解性較高的三辛酸甘油酯∶三丁酸甘油酯(1∶1)為油相、以廣泛應(yīng)用的磷脂為乳化劑、乙醇為助乳化劑,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道改良法制備三角相圖,即稱取磷脂∶油相(三辛酸甘油酯-三丁酸甘油酯=1∶1)9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8和1∶9,總量各為1g,振動(dòng)溶解,按照水/助乳化劑=1.2,比例加入上述溶液中直至溶液呈微渾濁狀,繪制磷脂/油/水-乙醇的三角相圖。1.3配方考察范圍在三角相圖微乳組成的磷脂/油/水-乙醇比例范圍之內(nèi),適量的加入PluronicF68作混合乳化劑進(jìn)行處方優(yōu)化。其處方中各因素考察范圍包括:5%～25%磷脂(x1)、10%～85%油相(x2)、5%～40%無水乙醇(x3)、1%～10%PluronicF68(x4)。利用乳劑的透光率與乳劑粒子大小具有相關(guān)性,故以透光率為指標(biāo),采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)處方中油相、助乳化劑、乳化劑等影響乳劑質(zhì)量的因素進(jìn)行優(yōu)化。2磷武酸染色后噴射電鏡觀察按照優(yōu)化處方制備自微乳,加水稀釋后,取適量用磷鎢酸染色后置投射電鏡下觀察其形態(tài)。同時(shí),樣品適量置激光散射儀中測(cè)定乳滴粒徑的大小及粒度分布。3大鼠單次固血實(shí)驗(yàn)按照6mg·kg-1的劑量分別給尾靜脈注射紫杉醇注射液和自微乳,分別于0.25,0.5,1,2,4,8,12和24h從眼眶取血,0.5～1.0mL,置肝素抗凝管中,2000×g離心10min后分離血漿,低溫冷凍備用,每組實(shí)驗(yàn)大鼠6只。3.1紫杉醇回復(fù)突變?cè)囼?yàn)dp法取空白血0.5mL置離心管中,2000×g離心10min,分離血漿150μL移至5mL離心管中,加入地西泮(內(nèi)標(biāo))5mg·L-1溶液50μL,依次加入0.1,0.25,0.5,0.75,1.0和1.5mL濃度為100mg·L-1紫杉醇溶液,依次用叔丁基甲醚萃取(每次1mL,3次),合并提取液,置40℃恒溫水浴上氮?dú)獯蹈?加入150μL流動(dòng)相溶解,進(jìn)樣20μL,以乙腈∶甲醇∶水(40∶25∶38)為流動(dòng)相,流速為0.8mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)227nm,記錄地西泮峰面積(dx)和紫杉醇峰面積(dp),以dp/dx之比對(duì)濃度回歸得方程:c=9.851dp/dx×10-6-0.1424,r=0.9974,線性范圍為10～150mg·L-1。3.2紫杉醇同法dsp取血樣150μL置離心管中,加入內(nèi)標(biāo)50μL,按照3.1項(xiàng)下自“依次用叔丁基甲醚萃取……”同法操作,進(jìn)樣50μL得dx和dp,根據(jù)dp/dx計(jì)算紫杉醇含量。3.3加標(biāo)回收率試驗(yàn)和日內(nèi)rsd取15支試管,各加入150μL空白血漿,平均分成3組,依次加入0.1,0.5和1.0mL濃度為100mg·L-1的紫杉醇溶液和5mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液50μl,按照3.1項(xiàng)下同法處理,進(jìn)樣20μL,計(jì)算紫杉醇峰的濃度和回收率。分別在日內(nèi)每隔3h進(jìn)樣1次(共3次),連續(xù)3d(樣品放置4℃貯存)。結(jié)果高、中、低3種濃度的回收率分別為(92±3)%,(97±3)%和(101±4)%;日內(nèi)RSD為2.91%,2.62%和2.41%;日間RSD為3.64%,4.66%和4.83%。3.4血液中藥物濃度的分析采用3P87程序,將不同時(shí)間內(nèi)血漿濃度數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行擬合,并計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。4行為及出現(xiàn)的毒副作用取豚鼠12只,隨機(jī)分為2組,每組6只,雌雄各半,分別按照10mg·kg-1,肌內(nèi)注射紫杉醇注射液和紫杉醇自微乳0.2～0.3mL,隔日注射,連續(xù)3次,觀察豚鼠行為及出現(xiàn)的毒副作用。其中2組中取一半于d7,由腹腔注射2～3mL,進(jìn)行攻擊。另一半于首次注射后d14腹腔注射相同劑量,并進(jìn)行觀察。根據(jù)2組豚鼠反應(yīng)的過敏癥狀不同,分為1～4級(jí)。0級(jí):無明顯反應(yīng);1級(jí):有輕微抓鼻、豎毛;2級(jí):有明顯的抓鼻、豎毛、顫抖或噴嚏;3級(jí):多次連續(xù)噴嚏、伴有呼吸困難或痙攣、抽搐;4級(jí):痙攣、抽搐、大小便失禁、休克、死亡。w/o乳劑的篩選取適量的紫杉醇油相,經(jīng)流動(dòng)相(乙腈∶甲醇∶水=40∶30∶30)稀釋10倍,進(jìn)樣20μL,紫杉醇的保留時(shí)間為9.01min,記錄峰面積,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算含量和在油相中的溶解度。紫杉醇在三辛酸甘油酯和三丁酸甘油酯的溶解度明顯高于玉米油和大豆油,見表1。綜合考慮增溶作用、毒性大小和乳化作用等因素,最終選擇三辛酸甘油酯-三丁酸甘油酯作為混合油相。由磷脂/混合油/水-乙醇制備的三角相圖結(jié)果見圖1。從圖中看出,由磷脂、油和水∶乙醇(1.2∶1)組成的系統(tǒng)可分為3個(gè)區(qū):乳劑(E),微乳(M)和各向同性(I)區(qū)。M區(qū)具有較好的流動(dòng)相和穩(wěn)定性特點(diǎn),其中M區(qū)中各項(xiàng)濃度范圍:磷脂為5%～27%;油相為8%～87%量,助乳化劑無水乙醇用量約為5%～42%、水的用量為6%～48%。處方中磷脂、油和乙醇按處方比例混合后,加入適宜水量后僅需輕微地機(jī)械振搖即可形成均勻、穩(wěn)定性的W/O乳劑。按照均勻設(shè)計(jì)U5(54)及相關(guān)使用表安排5種處方,配制總量為10mL的自微乳,每種處方中紫杉醇含量均為3mg,其他成分按照總量百分比稱取,超聲混合得微乳。取自微乳1mL置50mL量瓶中,加水至刻度,超聲2min,在分光光度計(jì)600nm下測(cè)定透光率,結(jié)果見表2。將各種因素的不同水平及相應(yīng)的T%數(shù)值代入《均勻設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)優(yōu)化程序》進(jìn)行逐步回歸:y=47.107-0.902x3-0.258x21+0.0722x3,F0=1346.68,r2=0.9998,S=0.409。因F0=1346.68>F0.05(3,1),檢驗(yàn)通過,最佳處方條件為:x1=5.06%,x3=29.9%。即自微乳處方為:紫杉醇30mg,磷脂5%,油相40%,無水乙醇30%,PluronicF68為4%。以優(yōu)選處方中各因素值進(jìn)行組方后配制自微乳,加入定量水稀釋,測(cè)定其透光率,結(jié)果平均透光率為(68±7)%。按照優(yōu)化處方制備自微乳,加水稀釋10倍,用激光散射儀測(cè)定乳滴粒徑的大小及形態(tài),粒徑為(16±3)nm,電鏡下觀察形態(tài)見圖2。自微乳外觀呈淡黃色透明粘稠液體、具有良好的穩(wěn)定性和流動(dòng)性。加10～20倍水后經(jīng)機(jī)械振蕩即可形成穩(wěn)定的微乳,呈乳白色半透明微乳液,具有良好的物理穩(wěn)定性,經(jīng)染色法鑒別呈W/O型微乳,24h內(nèi)未見有沉淀產(chǎn)生和分層現(xiàn)象。靜脈注射紫杉醇和自微乳后,測(cè)定血漿中藥物濃度,經(jīng)時(shí)過程見圖3。將血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)代入3P87程序,進(jìn)行模型擬合,以AIC為判據(jù),結(jié)合擬合度(r2)等相關(guān)指數(shù),確定藥物為二室模型,根據(jù)模型提取有關(guān)參數(shù),結(jié)果見表3。其中紫杉醇注射液的血漿藥動(dòng)學(xué)方程:c=27.30e-2.25t+3.02e-0.20t同樣,得紫杉醇自微乳的血漿藥動(dòng)學(xué)方程為:c=13.23e-2.27t+5.48e-0.25t紫杉醇自微乳在體內(nèi)的配置速率與注射液一致,消除速率兩者基本一致。但是自微乳的轉(zhuǎn)運(yùn)速率大于注射液,可能與微乳具有良好的細(xì)胞相容性和穿透性有關(guān)。將體內(nèi)藥物濃度數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)矩法進(jìn)行處理,得非隔室模型參數(shù)見表4。統(tǒng)計(jì)矩結(jié)果,紫杉醇注射液與自微乳體內(nèi)的MRT分別為2.52h和3.89h(P<0.05),兩者24h內(nèi)分AUC分別為26mg·h·L-1和31mg·h·L-1。提示,自微乳可有效延長(zhǎng)體內(nèi)的滯留時(shí)間,延長(zhǎng)療效。紫杉醇注射液具有明顯的過敏反應(yīng),豚鼠在第1次給藥后即出現(xiàn)抓鼻和大小便失禁現(xiàn)象;第2次給藥后出現(xiàn)嚴(yán)重大小便失禁、豎毛和抽搐現(xiàn)象,每只豚鼠均有不同程度的脫肛現(xiàn)象。紫杉醇自微乳組在第3次給藥后個(gè)別出現(xiàn)大小便失禁、精神萎靡不振、活動(dòng)量減小現(xiàn)象。2個(gè)給藥組比較,紫杉醇注射液組第1次注射后死亡3只,d14腹腔攻擊后有2只豚鼠死亡,顯示明顯的過敏反應(yīng)和毒性癥狀。藥物濃度和回收率對(duì)生物活性的影響實(shí)驗(yàn)采用多種油相進(jìn)行溶解度比較,其中以三辛酸甘油酯和三丁酸甘油酯對(duì)紫杉醇的溶解作用最為顯著。由于微乳的形成需要較大量的乳化劑而可能增加毒性,為此,采用改良三角相圖對(duì)磷脂/混合油/水-乙醇組成系統(tǒng)進(jìn)行多因素評(píng)價(jià),利用三相圖得到微乳區(qū)域中乳化劑和油相的比例和范圍,通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選微乳處方,使形成的微乳具有大小均勻,性狀穩(wěn)定的特定。同時(shí),試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微乳具有一定的觸變性,在接近臨界點(diǎn)組成的微乳放置過程中有形成普通微乳的趨勢(shì),故選擇助乳化劑用量時(shí)應(yīng)將乙醇∶水控制在1.2∶1～1.5。紫杉醇注射液和自微乳注射劑大鼠尾靜脈注射后體內(nèi)血漿藥物濃度數(shù)據(jù)經(jīng)模型嵌合均符合二室模型,藥動(dòng)學(xué)參數(shù)α,β沒有明顯差異,說明2種劑型的體內(nèi)分布速率相近。自微乳表觀分布容積均大于紫杉醇注射液,提示由于紫杉醇包封在微乳的油相中,在體內(nèi)由內(nèi)相擴(kuò)散到到血液中,其游離過程延長(zhǎng)導(dǎo)致清除率下降,體內(nèi)滯留時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)。同時(shí),自微乳有效地增大藥物的溶解度,有利于藥物向周邊組織分布。實(shí)驗(yàn)中分別采用乙醚和叔丁基甲醚提取血樣中的藥物,結(jié)果后者對(duì)蛋白的沉淀作用均優(yōu)于乙醚,雜質(zhì)干擾峰少,紫杉醇回收率高,且血樣萃取液不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,便于操作。采用HPLC測(cè)定紫杉醇生物樣本時(shí)通常以地西泮作內(nèi)標(biāo),經(jīng)系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)顯示,紫杉醇與內(nèi)標(biāo)的分離度受流動(dòng)相配比及流速的影響,按照一定比例甲醇-水和乙腈-水作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),紫杉醇與地西泮的分離度小于1,即兩者生物樣品不能有良好分離而影響測(cè)定結(jié)果。經(jīng)篩選采用乙腈-甲醇-