腎纖復(fù)元膠囊對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠腎臟cgf表達(dá)的影響

腎纖復(fù)元膠囊對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠腎臟cgf表達(dá)的影響

腎衰竭的終末期是各種原因的共線和主要病理基礎(chǔ)。對(duì)抗腎臟纖維化進(jìn)而延緩和保護(hù)腎臟功能的治療是目前研究的重點(diǎn)。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的合成,在腎臟纖維化進(jìn)程中有重要作用,成為目前防治腎臟纖維化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1裝膠囊的配方腎纖復(fù)元膠囊由我院康復(fù)科何成奇教授組方,其成分為三七、大黃、丹參、黃芪、雞內(nèi)金、生山楂、車前仁、昆布,為粉末裝膠囊。給藥前以“腎纖復(fù)元膠囊”制成湯劑。1.1.2測(cè)試試劑RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司,Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)sinma公司。1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠100只,體重140±20g。購(gòu)自四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。1.1.4主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備Beckman全自動(dòng)生化儀、DU-640紫外分光光度計(jì)、PTC-100PCR儀和GDS8000凝膠圖像分析系統(tǒng)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1腎損害切除方法大鼠用5/6腎切除方法建立慢性腎功能衰竭動(dòng)物模型。第一次手術(shù)切除左腎2/3,1周后行第二次手術(shù)切除右腎。假手術(shù)組20只僅在背部做一切口暴露腎臟后縫合,不切除腎臟。第二次手術(shù)后一周將手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組各40只。治療組予以“腎纖復(fù)元膠囊”灌胃,每日1次,0.3mg/kg/只。對(duì)照組予以相應(yīng)量的生理鹽水灌胃。1.2.2尿蛋白、清潔城鄉(xiāng)大鼠尿蛋白、清潔城鄉(xiāng)腎損害發(fā)生率檢測(cè)分別于4周、8周、12周以代謝籠采集尿樣測(cè)尿蛋白、清潔處死部分大鼠(例數(shù)見表),采集腹主動(dòng)脈血樣用Beckman全自動(dòng)生化儀進(jìn)行腎功能檢測(cè)。1.2.3腎總rna的檢測(cè)各組鼠處死后,立即清潔取腎。分別取各組鼠腎100mg,加入1mlTrizol試劑,提取各組鼠腎總RNA(據(jù)試劑說(shuō)明書),DU-640紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm的紫外光吸收值(OD260),根據(jù)OD260的值計(jì)算RNA濃度。1.2.4擴(kuò)增ctgfcnda片段根據(jù)文獻(xiàn)合成CTGF和β-actin寡核苷酸引物。CTGF:上游5‘-CTAAGACCTCTGGAATGGGC-3’,下游5‘-CTCAAAGAAGTCATTGCCCCC-3’,用這對(duì)引物可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為383bp的CTGFcDNA片段;β-actin:上游5‘-AACCGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTT-3’,下游5‘-GTGAAGCTCGTTCTCTACCGGCGTAGTAGC-3’,用這對(duì)引物可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為352bp的β-actincDNA片段。1.2.5圖像分析系統(tǒng)取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳40分鐘,紫外燈下成像,GDS8000凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描,并以β-actin為內(nèi)參照,作校正相對(duì)量分析,數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示。1.3統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.0版。2結(jié)果2.1大鼠腎衰和癥狀變化(1)假手術(shù)組:外觀、活動(dòng)正常,體重逐漸增大,到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到240±24g。死亡率為0。(2)對(duì)照組:與正常組比較。從第2周開始出現(xiàn)明顯多尿、食量減少、毛色發(fā)黃、弓背。第3周,上述表現(xiàn)加重,并出現(xiàn)明顯消瘦、眼珠紅色變淡。第4周,毛色萎黃、消瘦、眼珠變淡等進(jìn)一步加重食量仍少;被抓時(shí)反射性排尿量漸減少。第5周,前述變化進(jìn)一步加重,動(dòng)物少尿,開始有大鼠死亡。死亡鼠極消瘦。所剩鼠體重109±14g。死亡率20%。(3)治療組:第1到3周,變化與腎衰對(duì)照組相同。第4周大多數(shù)鼠毛皮光柔度、眼珠紅色度、食量等比腎衰組明顯改善,反射性排尿不減少反增多;少數(shù)幾只與腎衰對(duì)照組相似。第5周,本組也有死亡,但大多數(shù)鼠癥狀變化已出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。死亡率12.5%。2.2血尿素氮、胱、24日尿蛋白定量的比較對(duì)照組4周開始,血尿素氮(Bun)、肌酐(Cr)和24小時(shí)尿蛋白定量均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。隨著時(shí)間延長(zhǎng),對(duì)照組血尿素氮、肌酐和24小時(shí)尿蛋白定量增高更為明顯?！澳I纖復(fù)元膠囊”治療組從4周開始,血尿素氮、肌酐和24小時(shí)尿蛋白定量均低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組(P<0.05)。詳見表1。2.3周表達(dá)情況隨著時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)照組CTGF表達(dá)逐漸增高,12周表達(dá)最高。治療組CTGF表達(dá)雖然也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高,但均低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組(P<0.05)。3腎纖復(fù)元膠囊對(duì)慢性腎衰大鼠肝腎功能的作用慢性腎功能衰竭是多種慢性腎臟疾病進(jìn)展到晚期的嚴(yán)重綜合癥候群,是導(dǎo)致腎臟病患者死亡的主要原因,也為社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腎臟纖維化則是各種原因腎臟疾病進(jìn)展到慢性腎功能衰竭終末期的共同途徑。對(duì)抗腎臟纖維化進(jìn)而延緩和保護(hù)腎臟功能的治療是目前研究的重點(diǎn)。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)由Bradham等人于1991年,在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中首次分離得到。由于它在體外能刺激成纖維細(xì)胞的有絲分裂和趨化作用并因此命名。CTGF廣泛存在于很多人體組織器官中,包括心血管系統(tǒng)、胎盤、腦、肺、肝、肌肉、胃腸道、腎臟、前列腺和胰腺等,其中腎臟含量最高。CTGF表達(dá)于正常腎組織臟層與壁層上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、小管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)成纖維細(xì)胞。各種病因所致腎纖維化中,CTGF表達(dá)是增加的。例如,Ito等研究表明新月體腎小球腎炎、IgA腎病、局灶節(jié)段性腎小球腎炎、糖尿病腎病和Ⅳ型狼瘡性腎炎等各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病中CTGFmRNA表達(dá)顯著增加。CTGF參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的合成,在腎纖維化中有重要作用。因此,調(diào)控CTGF的表達(dá)有助于防止腎纖維化,延緩慢性腎功衰的進(jìn)展。中醫(yī)將慢性腎功能衰竭歸于“關(guān)格”、“癃閉”、“腎勞”、“腎風(fēng)”、“溺毒”、“水腫”等范疇,認(rèn)為本病大多屬于本虛標(biāo)實(shí)之證,正虛為本,邪實(shí)為標(biāo)。正虛方面多認(rèn)為屬于脾腎陽(yáng)虛、氣陰兩虛、肝腎陰虛;邪實(shí)方面則多集中在濕濁、瘀血、水氣的認(rèn)識(shí)。虛、濁、淤、毒四大因素互為因果,形成惡性循環(huán),其病變實(shí)質(zhì)是脾腎虛為本,淤血水濕為標(biāo)。腎纖復(fù)元膠囊正是根據(jù)這一病理特點(diǎn)按照中醫(yī)辨證施治的理論將三七、黃芪、丹參、大黃等中藥按一定配方精心研制的復(fù)方制劑,具有益氣健脾除濕,軟堅(jiān)活血化瘀的作用。方中重用丹參、大黃蕩滌留瘀敗血,配以三七起化瘀止血、活血消腫止痛之效,三藥相用共具化瘀止血而不留瘀血,共為君藥;黃芪、雞內(nèi)金、生山楂,具益氣健脾、溫腎化氣行水的作用,脾氣盛、腎陽(yáng)氣復(fù),水濕方得以運(yùn)化蒸騰,此共為臣藥;車前子、昆布具較強(qiáng)利水滲濕、通利小便之功,是為使藥。諸藥按一定比例配方使用使瘀祛新生、脾腎陽(yáng)氣得復(fù)、水濕腫滿得消。該藥為何成奇教授多年來(lái)臨床應(yīng)用于治療慢性腎功衰患者,取得較好療效,但其作用機(jī)制不明。本研究結(jié)果表明中藥