DB43-T 2816-2023魚類粘孢子蟲檢測(cè)方法地方標(biāo)準(zhǔn)

ICS65.020.3043CCSB4443湖 南 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB43/T2816—2023魚類粘孢子蟲檢測(cè)方法Detectionmethodsoffishmyxosporean20232023110920240209湖南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言 II范圍 1規(guī)性用1術(shù)和1試與1儀與1采樣 2檢步驟 2結(jié)判定 3附錄A（規(guī)性）劑其4附錄B（資性）同孢蟲染及包形態(tài) 5附錄C（資性）種見孢蟲孢子6前 言GB/T1.1—20201請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。究所。本文件主要起草人：劉新華、任詩思、皮杰、李德亮、向建國(guó)、余建波、呂欣榮、劉志輝、葉少文。魚類粘孢子蟲檢測(cè)方法范圍文件。SC/T7103水生動(dòng)物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范SC/T7223.11SC/T7223.22SC/T7223.33SC/T7223.44SN/T2503淡水魚中寄生蟲檢疫技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4試劑與材料本標(biāo)準(zhǔn)所使用的試劑均為分析純，水為蒸餾水。乙醇：7010xPCRBufferMIX：-20上游引物：5’-GATTGACGAGGTCGTTCGTTTA-3’；下游引物：5’-AGTAGGCCCTTACCCTACTTAC-3’；rRNA（18SrDNA）DNAmarker2000（bp）:2000、1000、750、500、250、100。5儀器與設(shè)備解剖盤、剪刀、鑷子、解剖針、解剖刀。體視顯微鏡和帶測(cè)微標(biāo)尺的光學(xué)顯微鏡。蓋玻片、載玻片、培養(yǎng)皿、巴氏吸管。恒溫水浴鍋（控溫范圍：RT-100℃±1℃）。-2080（0.5μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000PCR離心管和PCR采樣樣品的采集應(yīng)符合SC/T7103、SC/T7223.1、SC/T7223.2、SC/T7223.3和SC/T7223.4中的相關(guān)要求，樣品封存和運(yùn)輸應(yīng)符合SC/T7103的相關(guān)規(guī)定。目檢SN/T2503鏡檢7.120-30μL等）20-306.270%（附錄A）DNA將6.2固定的樣品充分混勻，破碎后用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次以去除殘余酒精。將離心管置于-80℃5min805min/DNADNA20PCR在50μL的PCR反應(yīng)體系中，包含模板基因組DNA2μL、10×PCRBufferMIX（康為世紀(jì)）25μL、上游引物和下游引物（10μM/L）各2μL、加雙蒸水定容至50μL。PCR94411min,3510min。PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。PCR5PCR1.0TAE（DNA900bp在，則取PCRGenBankBLAST目檢當(dāng)肉眼觀察到明顯白色包囊或白色囊狀物（見附錄B），可以懷疑為粘孢子蟲感染，但需經(jīng)8.2、8.3步驟檢查后才能進(jìn)一步確診。鏡檢8.2.28.18.2.1C）分子鑒定8.2.28.18.2.1C）分子鑒定18SrDNA（900bpGenBank80%附錄A（）70%70mL無水乙醇溶液，加30mLPBS緩沖液（0.01mol/L,pH7.4）。（0.01mol/L,pH7.4）7.9gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4（or1.44gNa2HPO4）1.8gK2HPO4800mlHClpH7.41L，4TAE（50）242.0gTris37.2gNa2EDTA·2H2O800mL57.1ml1L取溴酚藍(lán)100mg，加雙蒸水5mL,在室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，搖勻后加雙蒸水定容至50mL，加入氫氧化鈉（NaOH）溶液1滴，調(diào)至藍(lán)色。附錄B（資料性）不同粘孢子蟲感染癥狀及包囊形態(tài)圖B.1不同粘孢子蟲病感染癥狀(A)圖B.1不同粘孢子蟲病感染癥狀(A)1cm；(B)5cm；(C)5cm；(D)5mm；(E)：汪氏單極蟲感染異育銀鯽鰓癥狀，靶尺=0.5cm；(F)：