AtRAN1在擬南芥種子發(fā)育過程中的功能研究

摘要擬南芥（Arabidopsisthaliana）的種子由胚，胚乳和種皮三部分結構組成。種子的發(fā)育可以分為前期和后期兩個階段：在前期中，胚乳分裂速度較快，胚生長較慢；在后期中，胚利用胚乳的營養(yǎng)快速生長最終發(fā)育成熟，而胚乳逐漸被吸收利用最終消失。種子的發(fā)育受父母本基因組互作調控，即胚乳中父母本的基因組組成偏離正常1:2比例時，胚乳的發(fā)育出現(xiàn)異常，進而導致種子的發(fā)育異常。父母本基因組互作與基因印記現(xiàn)象緊密相聯(lián)。基因印記是兩個親本來源的等位基因在后代體細胞中有不同的表達活性的現(xiàn)象，在植物中出現(xiàn)在胚乳組織的發(fā)育過程中。然而，在植物中對于基因印記在種子發(fā)育中的作用還不清楚。本論文發(fā)現(xiàn)，AtRAN1作為擬南芥小G蛋白RAN家族成員之一，與基因印記相關。實驗結果表明：AtRAN1在間期主要在細胞核中定位，在有絲分裂期與紡錘體和成膜體有一定共定位。在生殖生長過程中AtRAN1在雌雄配子體及種子中均有表達并且控制著種子的大小。在AtRAN1下調表達的突變體株系與野生型（WT）正反交試驗中，當突變體作為母本授予WT花粉時，所結種子致死。當WT作為母本授予突變體的花粉時，種子體積減小。在AtRAN1過表達的株系與WT正反交中，種子也出現(xiàn)致死的表型。但是，過表達株系自交及突變體自交所結的種子相對正常，說明種子的發(fā)育可能與AtRAN1父母本的表達量比例相關，預示著AtRAN1可能是一類印記基因。對父母本AtRAN1在胚乳中表達模式的分析表明，父本的AtRAN1在胚乳發(fā)育的后期受到抑制，這表明在擬南芥的胚乳發(fā)育中AtRAN1是一個母本表達的印記基因。當AtRAN1父母本表達量比例發(fā)生改變以致種子發(fā)育致死時，AtRAN1在胚乳中表達模式發(fā)生改變，說明AtRAN1在胚乳中的表達模式與AtRAN1父母本表達量比例相關。同時，AtRAN1在胚乳中表達過量或不足均導致胚乳細胞化時間發(fā)生改變。當AtRAN1在胚乳中表達量過高時，細胞化延遲或不發(fā)生。當AtRAN1表達量降低，細胞化提前發(fā)生。兩種情況最終均影響種子的生長發(fā)育。AtMINISEED3（AtMINI3）編碼一類轉錄因子，調節(jié)胚乳細胞化發(fā)生時間早晚。我們發(fā)現(xiàn)AtMINI3在種子發(fā)育中的表達量與AtRAN1有一定的相關性，可能是AtRAN1的下游作用因子之一?？傊?，我們的研究表明，AtRAN1作為一個新的印記基因，通過AtRAN1在胚乳中的表達量來調節(jié)胚乳細胞化的起始和種子的發(fā)育。關鍵詞：種子；AtRAN1；小G蛋白；父母本比例；印記基因；胚乳；細胞化AbstractArabidopsis（Arabidopsisthaliana）lifecycleexperiencedthevegetativegrowthandthereproductivegrowth.Arabidopsisseedscouldbedividedintothreeparts:theembryo,endospermandtesta.SeeddevelopmentinArabidopsisthalianaundergoesaninitialphaseofendospermproliferationwhiletheembryogrowsslowlyfollowedbyasecondphaseinwhichtheembryogrowsfastbytakingadvantageoftheendospermnutrient.Parentalgenomeinteractionisimportantforseedgrowth,reflectedby1:2proportionofthepaternaltomaternalgenomemustbemaintainedinendospermdevelopmentotherwisetheseedswoulddevelopedabnormaly.Themolecularmechanismsoftheparentalgenomeinteractionstillneedtobeclarified.Parentalgenomeinteractionisassociatedwithgeneimprinting.Imprintedgenesaregenesexpressedprimarilyorexclusivelyfromeitherthematernalorpaternalallele,whichisessentialforembryodevelopmentinfloweringplantsandmammals.However,thefunctionofgenomicimprintingisunclear.Inthisstudy,asmallRAN-likeGTPasefromArabidopsis,AtRAN1,wasfoundtoexpressingametophyteanddevelopingseedinArabidopsis.Insub-cellularlocalization,AtRAN1isanucleusproteinininterphase,inmitosisitiscolocalizedwithspindleandphragmoplast.AtRAN1isubiquitouslyexpressedduringvegetativegrowthinArabidopsis.DownregulationofAtRAN1leadstosmaller-sizeflowersandseeds,indicatingthatAtRAN1hasaroleinseeddevelopment.However,inAtRAN1knock-downline（r1-2）crossedwithWTpollen,theseedsabort.Onthecontrary,whenWTiscrossedwithr1-2pollen,theseedsaresignificantlysmall.ThereciprocalcrossesofWTanddifferentAtRAN1overexpressionlinesindicatetheparentalAtRAN1ratiowouldbeimportantforendospermdevelopment.ThereciprocalcrossesofWTandAtRAN1promoterdrivingGUSline（pRAN1::GUS）showthatthepaternalexpressionofpRAN1::GUSisprohibitedinendosperminlaterendospermdevelopmentstage,whichindicatesthatAtRAN1isapredominantly-maternallyexpressedimprintedgene.Theproperexpressionof

AtRAN1

inendospermiscriticalfortheonsetofcellularization.Inr1-2crossedwithWTpollen,theAtRAN1expressionisabnormallyhigh,andcellularizationisdelayed.InWTcrossedwithr1-2pollen,theAtRAN1expressionislow,andcellularizationhappensearlierthanWT.Afterexpressionexamination,AtMINISEED3(AtMINI3)ispositivelyrelatedwithAtRAN1andmaybethedownstreamfactorofAtRAN1.Inconclusion,ourstudiesdemonstrate

theparentalAtRAN1ratioandproperexpressionof

AtRAN1inendosperm

iscriticalforseedmaturation.KEYWORDS：seed;AtRAN1;parentalratio;imprinting;endosperm;cellularization縮寫表RANRas-relatednuclearproteinGTPGuanosinetriphosphateCDSCodingseqencebpBasepairkDKilodaltonBY-2Brightyellowcell-2GUSβ-glucuronidasedNTPDeoxyribonucleosidetriphosphatePCRPolymerasechainreactionRT-PCRReversetranscriptPCRqRT-PCRQuantitative-realtimePCRDAPDaysafterplantDAHDaysafterhand-pollinationMCEMicropyleendospermCZEChalazalendospermPENPeripheralendpsermNCDNucleuscytoplasmdomainRFPRedfluorescenceproteinGFPAMGreenfluorescenceproteinAverage100seedseedmassDICDifferentialinterferencecontrastAmpAmpicillinKanKanamycinHygHygromycin目錄MACROBUTTONAcceptAllChangesInDoc摘要 IAbstract III第一章文獻綜述 11.1被子植物的種子發(fā)育過程 11.2影響種子發(fā)育的遺傳因素 51.2.1種子發(fā)育的調控基因 胚發(fā)育的調控基因 胚乳發(fā)育的調控基因 種皮發(fā)育的調控基因 胚，胚乳和種皮發(fā)育的相互影響 81.2.2種子發(fā)育的表觀遺傳調控 父母本基因組互作 基因組印記和印記基因 111.3小G蛋白RAN概述 131.3.1小G蛋白的概述和分類 131.3.2RAN的結構和功能 14本研究的目的和意義 19第二章材料和方法 202.1材料 202.1.1植物材料 202.1.2載體、菌株 202.1.3試劑、藥品 202.1.4溶液 GUS染色溶液 花粉萌發(fā)液 種子透明液 觀察胚乳細胞化所用溶液 培養(yǎng)基 抗生素 222.1.5儀器與設備 232.2方法 232.2.1分子生物學相關方法 擬南芥幼苗RNA提取 23種子RNA提取 RT-PCR T-DNA插入突變體精確插入位置鑒定及純合體鑒定原理 目的基因的擴增 PCR產物的回收和純化 2載體構建 2農桿菌感受態(tài)細胞的制備和外源基因轉化 272.2.2細胞生物學方法 2胚乳細胞化的觀察步驟 2種子透明化的觀察步驟 2基因槍瞬時轉化步驟 2農桿菌介導的擬南芥懸浮細胞和煙草BY-2懸浮細胞轉化步驟 2擬南芥懸浮細胞免疫熒光標記步驟 30細胞的DAPI染色 3熒光顯微鏡觀察方法 3浸花法構建轉基因植物步驟 3植株GUS染色步驟 30擬南芥植株表型的觀察與統(tǒng)計 322.2.3序列比對 332.2.4數(shù)據(jù)和圖象處理 33第三章結果與討論 343.1結果 343.1.1AtRAN1CDS序列的克隆及AtRAN1真核表達載體的構建 343.1.2AtRAN1的亞細胞定位 3AtRAN1在洋蔥表皮細胞中的定位 3AtRAN1在BY-2細胞及擬南芥懸浮細胞中的定位 3AtRAN1在擬南芥植株體細胞中的定位 383.1.3AtRAN1的突變體插入位點鑒定和組織特異性分布觀察 393.1.4AtRAN1的突變體植株表達水平鑒定 423.1.5AtRAN1的突變體植株表型分析 433.1.6AtRAN1的過表達植株表達水平鑒定和表型分析 453.1.7AtRAN1對種子子葉細胞數(shù)目和細胞大小的控制 473.1.8AtRAN1過表達植株地上部分表型鑒定 483.1.9AtRAN1突變體與WT正反交證明AtRAN1影響胚乳的發(fā)育 503.1.10AtRAN1父母本的表達量比例控制著胚乳發(fā)育 553.1.11AtRAN1在胚乳發(fā)育中是一個母本表達的印記基因 573.1.12AtRAN1的表達量控制著胚乳細胞化的起始 593.1.13AtRAN1調節(jié)控制細胞化的關鍵基因AtMINI3的表達 623.2討論 663.2.1AtRAN1在胚乳發(fā)育過程中是一個新的印記基因 663.2.2AtRAN1的表達量在胚乳發(fā)育過程中決定細胞化的起始 683.2.3結論 70參考文獻 71致謝 80第一章文獻綜述1.1被子植物的種子發(fā)育過程被子植物的種子由合子發(fā)育而來，而合子的發(fā)育過程起始于植物界中特有的雙受精過程（double-fertilization）。雙受精的具體過程是當被子植物的花粉管到達胚囊后，花粉管頂端破裂，釋放出兩個精細胞和花粉管內容物質，其中一個精細胞與卵細胞融合形成合子，將來發(fā)育成胚（embryo）；另一個精細胞與中央細胞的兩個極核融合形成初生胚乳核，將來發(fā)育成胚乳（endosperm）。圖1-1.擬南芥未受精的胚囊和發(fā)育中的種子示意圖（Sundaresan,2005）UnfertilizedOvule：未受精的胚囊。綠色圓點代表合子。棕色代表珠被。藍色圓點代表中央細胞。DevelopingSeed：發(fā)育中的種子。綠色心形結構代表胚。棕色代表珠被。淺棕色代表胚乳。MatureSeed：成熟種子。綠色代表胚。棕色代表種皮。淺棕色代表胚乳。被子植物的種子由胚、種皮和胚乳組成。其中，胚由受精卵發(fā)育而來，而種皮來源于母本孢子體的珠被結構，胚乳起源于受精的極核（圖1-1）。胚乳占據(jù)著種子的絕大部分體積。在禾谷類種子和主要油料作物種子中，胚乳是種子營養(yǎng)物質的貯藏場所。雙子葉植物的胚乳在胚的成熟過程中被胚自身的一部分即子葉吸收利用，而單子葉植物的胚乳直到種子成熟仍為游離的胚乳核。目前，單子葉植物禾谷類例如水稻，小麥和玉米等的成熟胚乳約承擔世界60%的糧食供應，是人類糧食的主要來源ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Berger</Author><Year>2009</Year><RecNum>342</RecNum><DisplayText>(張莉etal.,2004;BergerandChaudhury,2009)</DisplayText><record><rec-number>342</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">342</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Berger,Fred</author><author>Chaudhury,Abed</author></authors></contributors><titles><title>Parentalmemoriesshapeseeds</title><secondary-title>Trendsinplantscience</secondary-title></titles><periodical><full-title>Trendsinplantscience</full-title></periodical><pages>550-556</pages><volume>14</volume><number>10</number><dates><year>2009</year></dates><isbn>1360-1385</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>張莉</Author><Year>2004</Year><RecNum>343</RecNum><record><rec-number>343</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">343</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>張莉</author><author>毛雪</author><author>李潤植</author></authors></contributors><titles><title>種子發(fā)育相關基因的研究進展①</title><secondary-title>植物學通報</secondary-title></titles><periodical><full-title>植物學通報</full-title></periodical><pages>288-295</pages><volume>21</volume><number>3</number><dates><year>2004</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>(張莉etal.,2004;BergerandChaudhury,2009)。隨著世界人口的增加，對糧食的需求也大量增加,開展種子發(fā)育和育種相關領域的基礎研究工作對作物改良和糧食增產具有重要意義。擬南芥（Arabidopsisthaliana）種子發(fā)育過程為：胚珠經過受精后，卵細胞發(fā)育成合子。合子首先經過一段時間的休眠期，便開始進行細胞分裂發(fā)育成胚。胚的整個生長時期可以按照形態(tài)發(fā)育先后順序劃分為：球形胚時期，心形胚時期，魚雷形胚時期和子葉形胚時期。球形胚從受精卵的第一次橫向不均等分裂開始，形成大小不等的兩個細胞，靠近珠孔的細胞高度液泡化，稱為基細胞；遠離珠孔的細胞胞質較濃，稱為頂細胞?；毎^續(xù)進行多次橫向分裂，形成單列多細胞的結構，稱作胚柄。在胚柄不斷生長過程的同時，頂細胞相應進行分裂。首先發(fā)生兩次縱向分裂，形成包含4個細胞的胚。緊接著每個細胞進行一次橫向分裂，產生由8個細胞組成的8細胞胚。然后,這8個細胞各進行一次平周分裂，形成8個外層的原表皮細胞和8個內層細胞，即此時的球形胚包含16個細胞，稱為16細胞胚。當胚在不斷生長的同時，胚乳也在生長發(fā)育。體現(xiàn)在胚乳核的快速分裂。被子植物胚乳的發(fā)育是從極核受精后即受精極核又叫胚乳核開始的。胚乳核初期分裂速度較快，當受精卵進行第一次分裂時，胚乳核已經分裂4-5輪，數(shù)目達到24-28個ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>231</RecNum><DisplayText>(Boisnard-Lorigetal.,2001)</DisplayText><record><rec-number>231</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">231</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><plantcell13.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Boisnard-Lorig</Author><Year>2001</Year><RecNum>344</RecNum><record><rec-number>344</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">344</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Boisnard-Lorig,Corinne</author><author>Colon-Carmona,Adan</author><author>Bauch,Marion</author><author>Hodge,Sarah</author><author>Doerner,Peter</author><author>Bancharel,Estelle</author><author>Dumas,Christian</author><author>Haseloff,Jim</author><author>Berger,Frédéric</author></authors></contributors><titles><title>DynamicanalysesoftheexpressionoftheHISTONE::YFPfusionproteininArabidopsisshowthatsyncytialendospermisdividedinmitoticdomains</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>495-509</pages><volume>13</volume><number>3</number><dates><year>2001</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Boisnard-Lorigetal.,2001)（表1-1）。胚乳的發(fā)育進程較早于胚的發(fā)育，其重要意義是為幼胚的生長發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質，并對幼嫩的胚提供保護。胚利用這些營養(yǎng)物質不斷發(fā)育，32細胞胚球形胚之后，球形胚頂端兩側部位的細胞分裂較快，形成兩個突起即子葉原基，之后發(fā)育成子葉。此時整個胚體呈心形，稱為心形胚。胚乳核經過核的多次分裂，已經達到多余200個的細胞核（表1-1）。這些核都不產生細胞壁而游離分散于胚囊中，即產生一個多核細胞合胞體（圖1-2,1-3）。此時的每個胚乳核由一個胞質球和放射狀的微管系統(tǒng)圍繞，稱為核質域（nucleuscytoplasmdomain-NCD）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Pignocchietal.,2009)。在合胞體時期，擬南芥胚乳可被分為三個區(qū)域：在珠孔端圍繞胚的胚乳稱為珠孔區(qū)胚乳（micropylarendosperm-MCE），在合點端的胚乳稱為合點區(qū)胚乳（chalazalendosperm-CZE）以及位于珠孔胚乳與合點胚乳之間的胚乳稱為外周胚乳（peripheralendosperm-PEN）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Boisnard-Lorig</Author><Year>2001</Year><RecNum>344</RecNum><DisplayText>(MansfieldandBriarty,1990;Boisnard-Lorigetal.,2001)</DisplayText><record><rec-number>344</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">344</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Boisnard-Lorig,Corinne</author><author>Colon-Carmona,Adan</author><author>Bauch,Marion</author><author>Hodge,Sarah</author><author>Doerner,Peter</author><author>Bancharel,Estelle</author><author>Dumas,Christian</author><author>Haseloff,Jim</author><author>Berger,Frédéric</author></authors></contributors><titles><title>DynamicanalysesoftheexpressionoftheHISTONE::YFPfusionproteininArabidopsisshowthatsyncytialendospermisdividedinmitoticdomains</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>495-509</pages><volume>13</volume><number>3</number><dates><year>2001</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Mansfield</Author><Year>1990</Year><RecNum>345</RecNum><record><rec-number>345</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">345</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Mansfield,SG</author><author>Briarty,LG</author></authors></contributors><titles><title>EndospermcellularizationinArabidopsisthalianaL</title><secondary-title>ArabidopsisInf.Serv</secondary-title></titles><periodical><full-title>ArabidopsisInf.Serv</full-title></periodical><pages>65-72</pages><volume>27</volume><dates><year>1990</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>(MansfieldandBriarty,1990;Boisnard-Lorigetal.,2001)（圖1-2）。圖1-2.擬南芥胚乳區(qū)域的劃分（Gehringetal.,2004）MCE：珠孔區(qū)胚乳。CZE：合點區(qū)胚乳。PEN：外周胚乳。EM：胚。圖1-3.擬南芥胚乳發(fā)育階段（Boisnard-LorigC.,2001）A-H.受精后的胚乳到心形胚時期的胚乳的發(fā)育情況。A.受精極核未分裂時。B.受精極核分裂一次。C.胚乳核分裂兩次。D.胚乳核分裂三次。E.一細胞胚時期。F.四細胞胚時期。G.球形胚時期。H.心形胚時期。表1-1.擬南芥胚乳發(fā)育階段和各階段的胚乳細胞核數(shù)目統(tǒng)計（Boisnard-LorigC.,2001）EndospermDevelopmentalStage：胚乳發(fā)育階段。No.ofEndospermNuclei：胚乳細胞核數(shù)目。EmbyoDevelopmentalStage：胚發(fā)育階段。TimeafterFertilization：受精后時間（小時）。CytologicalEvents：細胞學事件。隨著胚囊內中央液泡的形成與擴大，NCD被擠向胚囊的周緣，此時胚乳由圍繞大的中央液泡的一層NCD組成。在胚由早心形胚時期向晚心形胚時期發(fā)育的時候，NCD周圍開始出現(xiàn)細胞壁，稱為胚乳細胞化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Brownetal.,1999;Hehenbergeretal.,2012)。細胞化首先發(fā)生在MCE，然后是PEN發(fā)生細胞化。例外的是，CZE不發(fā)生細胞化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(MansfieldandBriarty,1990;Brownetal.,1999;Boisnard-Lorigetal.,2001;S?rensenetal.,2002;FiumeandFletcher,2012)。細胞化的胚乳能供應后期胚發(fā)育所需的養(yǎng)分，也是種子發(fā)育的關鍵步驟，對種子的成熟意義重大。細胞化起始的分子機制現(xiàn)在還處于探索階段，但相關的研究表明細胞化的起始與胚乳核分裂的數(shù)目有一定關系ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Guitton</Author><Year>2004</Year><RecNum>348</RecNum><DisplayText>(MansfieldandBriarty,1990;Guittonetal.,2004)</DisplayText><record><rec-number>348</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">348</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Guitton,Anne-Elisabeth</author><author>Page,DamianR</author><author>Chambrier,Pierre</author><author>Lionnet,Claire</author><author>Faure,Jean-Emmanuel</author><author>Grossniklaus,Ueli</author><author>Berger,Frédéric</author></authors></contributors><titles><title>IdentificationofnewmembersofFertilisationIndependentSeedPolycombGrouppathwayinvolvedinthecontrolofseeddevelopmentinArabidopsisthaliana</title><secondary-title>Development</secondary-title></titles><periodical><full-title>Development</full-title></periodical><pages>2971-2981</pages><volume>131</volume><number>12</number><dates><year>2004</year></dates><isbn>0950-1991</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Mansfield</Author><Year>1990</Year><RecNum>345</RecNum><record><rec-number>345</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">345</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Mansfield,SG</author><author>Briarty,LG</author></authors></contributors><titles><title>EndospermcellularizationinArabidopsisthalianaL</title><secondary-title>ArabidopsisInf.Serv</secondary-title></titles><periodical><full-title>ArabidopsisInf.Serv</full-title></periodical><pages>65-72</pages><volume>27</volume><dates><year>1990</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>(MansfieldandBriarty,1990;Guittonetal.,2004)，例如，由于某些因素導致胚乳細胞化發(fā)生的過早時，胚乳細胞核的數(shù)目往往比較少。而當胚乳細胞化發(fā)生的過晚時或不發(fā)生時，胚乳細胞核的數(shù)目往往比較多ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Scott</Author><Year>1998</Year><RecNum>21</RecNum><DisplayText>(Scottetal.,1998)</DisplayText><record><rec-number>21</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">21</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Scott,R.J.</author><author>Spielman,M.</author><author>Bailey,J.</author><author>Dickinson,H.G.</author></authors></contributors><titles><title>Parent-of-origineffectsonseeddevelopmentinArabidopsisthaliana</title><secondary-title>Development</secondary-title></titles><periodical><full-title>Development</full-title></periodical><pages>3329-3341</pages><volume>125</volume><number>17</number><dates><year>1998</year></dates><isbn>0950-1991</isbn><urls><related-urls><url>/content/125/17/3329.full.pdf</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(Scottetal.,1998)。胚乳包含過多的不發(fā)生細胞化的胚乳核和過少的胚乳核均會導致胚對胚乳的營養(yǎng)吸收出現(xiàn)問題而導致種子發(fā)育出現(xiàn)異常。因此，正常的細胞化起始時間對種子的發(fā)育至關重要，過早或過晚發(fā)生均影響種子的發(fā)育和最終形態(tài)。心形胚時期之后，子葉原基處細胞繼續(xù)分裂生長延伸，形成兩片形狀大小相似的子葉。子葉基部的胚軸也相應伸長，這時整個胚體呈魚雷形，叫做魚雷形胚時期。魚雷形胚時期之后，整個胚繼續(xù)生長，子葉占據(jù)大部分胚囊，這時的胚體叫做子葉胚，繼續(xù)發(fā)育為成熟胚。成熟胚占滿了整個胚囊。此時的胚乳已經被胚完全吸收而消失或只剩下一層細胞ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(MansfieldandBriarty,1991;LopesandLarkins,1993;Weijersetal.,2001;Sundaresan,2005)。除了胚的發(fā)育和胚乳的發(fā)育，種皮的發(fā)育也十分重要。成熟的種子中種皮位于種子的最外層，是保護結構。擬南芥具有兩層種皮，外種皮由外珠被發(fā)育而來，內種皮由內珠被發(fā)育而來。種皮的發(fā)育與胚的發(fā)育和胚乳的發(fā)育是相互影響相互聯(lián)系的ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sundaresan</Author><Year>2005</Year><RecNum>55</RecNum><DisplayText>(Sundaresan,2005)</DisplayText><record><rec-number>55</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">55</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Sundaresan,V.</author></authors></contributors><titles><title>Controlofseedsizeinplants</title><secondary-title>ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica</secondary-title></titles><periodical><full-title>ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica</full-title></periodical><pages>17887</pages><volume>102</volume><number>50</number><dates><year>2005</year></dates><isbn>0027-8424</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Sundaresan,2005)（圖1-1）。1.2影響種子發(fā)育的遺傳因素種子的正常發(fā)育是植物延續(xù)種群生命和完成進化的前提。人們對植物種子發(fā)育相關突變體進行篩選和分析，已鑒定和分離出了一些影響種子發(fā)育的基因。這些基因分別或共同控制著種子的種皮，胚乳和胚的發(fā)育。基因缺失后，種子各部分的發(fā)育可能出現(xiàn)異常：例如胚體發(fā)育喪失極性、胚乳分裂速度減緩或增加、種皮無法積累色素導致發(fā)育異常等。隨著研究的不斷深入，許多單基因的表達方式被證明在種子的發(fā)育過程中具有特異性。除了單基因對種子發(fā)育的調控，不同劑量親本基因組之間的互作對種子發(fā)育也有影響。在孟德爾定律中，來自父本和母本的等位基因對有性生殖產生合子體的發(fā)育過程起到同等重要的作用。但早期以玉米作為實驗材料發(fā)現(xiàn)，來自父本或母本的基因組在種子發(fā)育早期階段的作用不是等同的。幾年之后，這一點在擬南芥種子中也得到證實ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lin</Author><Year>1984</Year><RecNum>72</RecNum><DisplayText>(Lin,1984;Scottetal.,1998)</DisplayText><record><rec-number>72</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">72</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lin,B.Y.</author></authors></contributors><titles><title>Ploidybarriertoendospermdevelopmentinmaize</title><secondary-title>Genetics</secondary-title></titles><periodical><full-title>Genetics</full-title></periodical><pages>103-115</pages><volume>107</volume><number>1</number><dates><year>1984</year></dates><isbn>0016-6731</isbn><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Scott</Author><Year>1998</Year><RecNum>21</RecNum><record><rec-number>21</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">21</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Scott,R.J.</author><author>Spielman,M.</author><author>Bailey,J.</author><author>Dickinson,H.G.</author></authors></contributors><titles><title>Parent-of-origineffectsonseeddevelopmentinArabidopsisthaliana</title><secondary-title>Development</secondary-title></titles><periodical><full-title>Development</full-title></periodical><pages>3329-3341</pages><volume>125</volume><number>17</number><dates><year>1998</year></dates><isbn>0950-1991</isbn><urls><related-urls><url>/content/125/17/3329.full.pdf</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(Lin,1984;Scottetal.,1998)。此后，許多基因的作用方式被發(fā)現(xiàn)具有親源效應（parent-of-origineffect），即相同的等位基因由于父母本來源不同而在子代中有不同的表達ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Gehring</Author><Year>2011</Year><RecNum>83</RecNum><DisplayText>(Gehringetal.,2011)</DisplayText><record><rec-number>83</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">83</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Gehring,M.</author><author>Missirian,V.</author><author>Henikoff,S.</author></authors></contributors><titles><title>Genomicanalysisofparent-of-originallelicexpressioninArabidopsisthalianaseeds</title><secondary-title>PLoSOne</secondary-title></titles><periodical><full-title>PLoSOne</full-title></periodical><pages>e23687</pages><volume>6</volume><number>8</number><dates><year>2011</year></dates><isbn>1932-6203</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Gehringetal.,2011)。這些基因受到表觀調控（epigeneticprocess）。表觀調控包括DNA甲基化/去甲基化，組蛋白甲基化/去甲基化和組蛋白乙?；?去乙?；?。表觀調控產生的結果是：它們影響基因的表達時間和表達部位但是不影響基因的本來序列ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Adamsetal.,2000;Grossniklausetal.,2001;Gehringetal.,2004)。父本和母本染色體組之間復雜的互作，涉及到表觀調控下的多基因的表達量變化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Grossniklausetal.,2001;Gehringetal.,2004;Gehringetal.,2011;Hsiehetal.,2011;Ikeda,2012;JiangandK?hler,2012)。由于表觀調控的復雜和重要性，這使得種子發(fā)育的表觀遺傳調控研究迅速成為當今生殖生物學熱點研究領域之一ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Ikeda</Author><Year>2012</Year><RecNum>96</RecNum><DisplayText>(Ikeda,2012)</DisplayText><record><rec-number>96</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">96</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Ikeda,Y.</author></authors></contributors><titles><title>Plantimprintedgenesidentifiedbygenome-wideapproachesandtheirregulatorymechanisms</title><secondary-title>PlantandCellPhysiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>PlantandCellPhysiology</full-title></periodical><pages>809-816</pages><volume>53</volume><number>5</number><dates><year>2012</year></dates><isbn>0032-0781</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Ikeda,2012)。1.2.1種子發(fā)育的調控基因種子的發(fā)育涉及到一系列基因的時空特異性表達和相互作用。在模式植物擬南芥中，人們對影響胚發(fā)育、胚乳發(fā)育和種皮發(fā)育的突變體進行篩選和分析，已鑒定和分離了一些影響胚，胚乳和種皮形態(tài)建成的主要基因。胚發(fā)育的調控基因調控胚生長發(fā)育的基因包括調控胚胎極性建立過程的基因和調控后期形態(tài)建成過程中的基因，例如:EMB30/GNOM、SHORTSUSPENSOR（SSP）、LEAFYCOTYLEDON2（LEC2）、WUS、FACKEL（FK）和SHB1（SHORTHYPCOTYLUNDERBLUELIGHT1）等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Shevelletal.,1994;Hecketal.,1995;Lauxetal.,1996;Schricketal.,2000;SantosMendozaetal.,2005;Portereikoetal.,2006;Steffenetal.,2008;Bayeretal.,2009a;Zhouetal.,2009;Klimaszewskaetal.,2010;沈秀平etal.,2012)。EMB30編碼的產物屬于鳥嘌呤核苷酸交換因子，它作用于小G蛋白ARF-GDP/ARF-GTP之間的轉化。缺失突變體打破了受精卵的第一次分裂的不對稱性，喪失了頂端-基部極性（apical-basalpolarity），導致胚無法發(fā)育。SSP蛋白的父本特異表達對胚柄的延長是必須的，變短的胚柄導致胚致死。LEC2編碼一個的轉錄調控因子。LEC2結合到植物所特有的DNA結合基序B3區(qū)域，啟動胚的正常發(fā)育。WUS是擬南芥胚分生組織形成中一個重要的調控基因。在WUS突變體胚發(fā)育中,分生組織發(fā)育受到抑制，結果是產生缺失胚頂端分生組織無法產生子葉的胚。FK基因的產物是一種固醇還原酶，參與脂類生物合成。該基因突變導致胚細胞的分裂和擴張生長受阻，產生無下胚軸的胚。SHB1作為光信號通路因子對胚體的作用也是首次被發(fā)現(xiàn)。SHB1編碼一個藍光受體，在胚的發(fā)育中控制胚細胞分裂的數(shù)目而非大小。SHB1突變導致胚體積減小，過表達導致胚變大。胚乳發(fā)育的調控基因調控胚乳生長發(fā)育的基因包括TITAN（TTN）家族成員，F(xiàn)ERTILIZATION-INDEPENDENTSEED（FIS）家族基因成員（FIS1,FIS2,FIS3），PHERES1（PHE1），F(xiàn)ORMINHOMOLOG5（FH5），ENDOSPERMDEFECTIVE1（EDE1），AGAMOUS-Like62（AGL62），AGAMOUS-Like80（AGL80），HAIKU家族基因成員（IKU1,IKU2）和MINISEED3（MINI3）等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Garciaetal.,2003;Ingouffetal.,2005;Luoetal.,2005;Portereikoetal.,2006;Hehenbergeretal.,2012)，TTN家族蛋白大多編碼染色質黏連蛋白，其中TTN1編碼一個微管作用因子，TTN1突變導致胚乳中產生巨大的多倍性的核，可能與微管的動態(tài)組裝失敗有關ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Tzafrir</Author><Year>2002</Year><RecNum>364</RecNum><DisplayText>(Tzafriretal.,2002)</DisplayText><record><rec-number>364</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">364</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Tzafrir,Iris</author><author>McElver,JohnA</author><author>Liu,Chun-ming</author><author>Yang,LiJun</author><author>Wu,JiaQian</author><author>Martinez,Audrey</author><author>Patton,DavidA</author><author>Meinke,DavidW</author></authors></contributors><titles><title>DiversityofTITANfunctionsinArabidopsisseeddevelopment</title><secondary-title>Plantphysiology</secondary-title></titles><periodical><full-title>Plantphysiology</full-title></periodical><pages>38-51</pages><volume>128</volume><number>1</number><dates><year>2002</year></dates><isbn>0032-0889</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Tzafriretal.,2002)。除此之外，一些微絲微管相關蛋白基因突變后也導致胚乳發(fā)育的異常。例如FH5，EDE1的突變體胚乳發(fā)育均異常。FH5的突變體CZE胚乳發(fā)育異常并出現(xiàn)多核聚集現(xiàn)象ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Ingouffetal.,2005;Luoetal.,2005)。EDE1的突變體的NCD周圍微管遭到破壞，導致胚乳發(fā)育異常。FIS1/MEDEA、FIS2和FIS3/FIE（FERTILIZATION-INDEPENDENTENDOSPERM）基因產物均在胚乳中表達，其突變體均能在未受精的情況下自主開始胚乳核的分裂。在受精之后，突變體出現(xiàn)細胞化延遲或不發(fā)生細胞化的現(xiàn)象ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Grossniklausetal.,1998;Luoetal.,2000;Yadegarietal.,2000;Grossniklausetal.,2001;Luoetal.,2005;Barouxetal.,2006;Hsiehetal.,2011)。PHE1是一個在胚乳中父本特異表達的基因。雖然突變體未發(fā)現(xiàn)表型，但PHE1突變體可以恢復FIS1突變帶來的胚乳細胞化發(fā)生延遲的表型，說明兩者是有相互作用的ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Kohleretal.,2005)。AGL62（AGAMOUS-Like62）是一個轉錄因子，編碼一個Ⅰ型MADS-BOX功能域蛋白ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kang</Author><Year>2008</Year><RecNum>225</RecNum><DisplayText>(Kangetal.,2008)</DisplayText><record><rec-number>225</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">225</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kang,I.H.</author><author>Steffen,J.G.</author><author>Portereiko,M.F.</author><author>Lloyd,A.</author><author>Drews,G.N.</author></authors></contributors><titles><title>TheAGL62MADSdomainproteinregulatescellularizationduringendospermdevelopmentinArabidopsis</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>635-647</pages><volume>20</volume><number>3</number><dates><year>2008</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls><related-urls><url>/content/20/3/635.full.pdf#page=1&view=FitH</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(Kangetal.,2008)。在種子發(fā)育過程中，AGL62在合胞體胚乳中高表達，在胚乳發(fā)生細胞化之前表達量迅速下降，這說明AGL62抑制細胞化的起始。在AGL62突變體種子中，胚乳細胞化提前。擬南芥AGL80（AGAMOUS-Like80）基因是中央細胞和胚乳發(fā)育所必需的一個基因ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Portereiko</Author><Year>2006</Year><RecNum>355</RecNum><DisplayText>(Portereikoetal.,2006)</DisplayText><record><rec-number>355</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="xwpdxrz2zwva9se00fn552sjdtv00saft0st">355</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Portereiko,MichaelF</author><author>Lloyd,Alan</author><author>Steffen,JoshuaG</author><author>Punwani,JaysonA</author><author>Otsuga,Denichiro</author><author>Drews,GaryN</author></authors></contributors><titles><title>AGL80isrequiredforcentralcellandendospermdevelopmentinArabidopsis</title><secondary-title>ThePlantCellOnline</secondary-title></titles><periodical><full-title>ThePlantCellOnline</full-title></periodical><pages>1862-1872</pages><volume>18</volume><number>8</number><dates><year>2006</year></dates><isbn>1040-4651</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>(Portereikoetal.,2006)。AGL80也在中央細胞和胚乳發(fā)育的早期表達。AGL62和AGL80在中央細胞的發(fā)育過程中相互作用，有可能形成異源二聚體共同保證中央細胞的正常發(fā)育。同時，又有證據(jù)表明AGL62在細胞化起始方面的作用是受FIS家族基因成員FIS2的直接或間接調控的。除此之外，影響胚乳發(fā)育的調控基因還包括HAIKU（IKU）家族成員。這類基因包含IKU1,IKU2。IKU2編碼一類受體激酶，在IKU2突變體中，種子變小，胚乳細胞化提前。MINISEED3是一類WRKY轉錄因子，名為WRKY10/MINISEED3（MINI3）（Garciaetal.,2003;Luoetal.,2005）。在MINI3突變體中，種子變小，胚乳細胞化提前。有證據(jù)表明MINI3和IKU2突變體具有類似的表型，在胚乳發(fā)育調控上存在相互作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Luo</Author><Year>2005</Year><RecNum>54</RecNum><Display