實(shí)驗(yàn)二-植物核酸的提取教案

授課教師學(xué)生人數(shù)55課題實(shí)驗(yàn)二植物基因組DNA的提取授課類型新授課授課方法講授、演示教學(xué)用具多媒體教學(xué)目的掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理與方法教學(xué)重點(diǎn)理解每一步實(shí)驗(yàn)操作的目的教學(xué)難點(diǎn)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的一些注意事項(xiàng)教學(xué)過(guò)程背景知識(shí)1.DNA在細(xì)胞中存在的位置？植物細(xì)胞DNA存在的位置和動(dòng)物細(xì)胞有何不同？（圖） 2.DNA的存在形式雙螺旋結(jié)構(gòu)圖雙螺旋結(jié)構(gòu)組成染色體是怎樣形成的？一級(jí)結(jié)構(gòu)（核小體=雙螺旋+組蛋白）-二級(jí)結(jié)構(gòu)（螺線管）-三級(jí)結(jié)構(gòu)（超螺線管）-四級(jí)結(jié)構(gòu)（染色體）真核生物基因組DNA是經(jīng)過(guò)四級(jí)包裝形成了染色體，先是DNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，再與組蛋白形成核小體（一級(jí)結(jié)構(gòu)），壓縮7倍，再形成螺旋管（二級(jí)結(jié)構(gòu)），壓縮6倍，之后再形成超螺旋管（三級(jí)結(jié)構(gòu)），壓縮40倍，最后超螺旋管壓縮形成染色體（四級(jí)結(jié)構(gòu)），再壓縮5倍，正常細(xì)胞中基因組DNA是以染色質(zhì)（相當(dāng)于一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式存在，在細(xì)胞分裂的中期以染色體形式存在，真核生物細(xì)胞質(zhì)DNA主要是以裸露的環(huán)狀DNA形式存在，沒(méi)有核小體結(jié)構(gòu)。3.遺傳物質(zhì)核酸除了DNA外還有另外一種，即RNA，它與DNA在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別？（圖）RNA基本單位中間的五碳糖是核糖，含氮堿基尿嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）4.核酸的理化性質(zhì)（1）形狀：DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。（2）溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、異丙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。（3）保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理2.CTAB法提取植物基因組DNA的實(shí)驗(yàn)方法三、實(shí)驗(yàn)原理1.核酸在細(xì)胞中的存在方式，是以核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在，如一級(jí)結(jié)構(gòu)核小體（圖）：DNA螺旋+組蛋白2.通過(guò)低溫研缽破壞植物細(xì)胞壁3.加入CTAB溶解細(xì)胞膜，CTAB與核酸形成核酸-CTAB復(fù)合物，使核酸與蛋白質(zhì)分離。4.加入高鹽溶液溶解核酸-CTAB復(fù)合物，加入蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)變性沉淀出來(lái)，離心除去蛋白質(zhì)。5.加入核酸沉淀劑，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出來(lái)，離心得到核酸沉淀。四、實(shí)驗(yàn)儀器1.水浴鍋2.離心機(jī)（12管）：3臺(tái)3.研缽：10個(gè)4.移液槍（包括槍頭）：1ml、400ul五、實(shí)驗(yàn)材料與藥品實(shí)驗(yàn)材料：新鮮菠菜葉片1.十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）作用：溶解細(xì)胞膜并與核酸結(jié)合，便于分離核酸。商品信息：瓶裝/100g理化性質(zhì)：白色或淺黃色結(jié)晶體至粉末狀，有刺激氣味，易溶于異丙醇，可溶于水,震蕩時(shí)產(chǎn)生大量泡沫，化學(xué)穩(wěn)定性好，耐熱、耐光、耐壓、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿。有吸濕性，在酸性溶液中穩(wěn)定；溶于10份水，溶于熱水、乙醇、三氯甲烷,易溶于異丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。儲(chǔ)存：在陰涼，干燥，通風(fēng)良好的地方，遠(yuǎn)離不相容的物質(zhì)。危害：高毒，對(duì)皮膚及粘膜刺激性小，有輕微脫脂作用。2.1MTris-HClPH8.0緩沖液作用：提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞商品信息：分析純理化性質(zhì)：-196℃。液態(tài)的氮?dú)狻Ｊ嵌栊缘?，無(wú)色，無(wú)臭，無(wú)腐蝕性，不可燃，溫度極低。儲(chǔ)存：儲(chǔ)存于陰涼、通風(fēng)的庫(kù)房。庫(kù)溫不宜超過(guò)30℃危害：汽化時(shí)大量吸熱接觸造成凍傷。六、實(shí)驗(yàn)試劑1.氯仿-異戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml{氯仿96ml+異戊醇4ml}=100ml，4℃2.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）40ml{氯仿-異戊醇（24:1）20ml+Tris飽和酚20ml}=40ml，4℃3.TE緩沖液PH8.050ml{10mMTris-HCl（PH8.0）緩沖液0.5ml+0.5MEDTA（PH8.0）0.1ml}→→定容到50ml→高壓滅菌后冷卻4℃【0.5MEDTA（PH8.0）】的配制：100ml{蒸餾水80ml+EDTA-2Na.2H2O18.61g}→用NaOH（約2g）調(diào)至PH8.0→→分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調(diào)至PH8.0才能完全溶解。【10mMTris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml{1MTris-HClPH8.0緩沖液100μl+水9.9ml}→定容至10ml→10mMTris-HCl（PH8.0）緩沖液4.2%CTAB抽提液250ml{CTAB4g+無(wú)水乙醇5ml+水100ml}→加入200ml燒杯中→加熱溶解→再依次加入→→{5MNaCl56ml+1MTris-HCl（PH8.0）20ml+0.5MEDTA8ml}→定容至250ml→高壓滅菌冷卻后加入→{1%β-巰基乙醇（400ul）2ml+PVP-405g}→4℃【5MNaCl溶液】配制：100ml{NaCl29.22g+水90ml}→加熱到80℃溶解冷卻后→定容至100ml→【1%（v/v）β-巰基乙醇】配制：10ml{β-巰基乙醇100μl+水9.9ml}→1%β-巰基乙醇10ml5.蒸餾水所有藥劑用水都要純凈水經(jīng)高壓滅菌冷卻七、實(shí)驗(yàn)步驟（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1.研缽、異丙醇-20℃2.將2%CTAB抽提液從4℃冰箱內(nèi)取出在65℃3.稱取30份新鮮菠菜葉片，每份1g，稱重時(shí)去葉脈；【菠菜葉片30g】4.用蒸餾水沖洗葉片，濾紙吸干水分，將葉片用剪刀剪小。【洗瓶、濾紙、剪刀】5.實(shí)驗(yàn)器材：冰箱、65℃水浴鍋、液氮、10ml離心管90個(gè)、藥匙、移液槍（1ml、100μl、400μl）6.實(shí)驗(yàn)藥劑：酚-氯仿-異戊醇30ml（每管1ml）、氯仿-異戊醇60ml（每管2ml）、無(wú)水乙醇12ml（每管400μl）、TE緩沖液3ml（每管100μl）（二）破碎細(xì)胞，釋放溶解核酸1.將葉片置于預(yù)冷的研缽（實(shí)驗(yàn)前-20℃預(yù)冷）目的：低溫導(dǎo)致植物組織凍裂，方便研磨使細(xì)胞破碎，使DNA釋放完全；低溫情況下各酶處于低活性狀態(tài)，有利于抑制DNase的作用，保護(hù)DNA。2.將粉末加入10ml離心管中，加入1ml預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動(dòng)搖勻；目的：CTAB可以溶解細(xì)胞膜并與DNA結(jié)合，便于分離DNA。加入β-巰基乙醇和PVP-40的目的是減少植物中酚類物質(zhì)的影響。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。Tris-HCl提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止DNA被破壞。高鹽溶液可以更好的溶解核酸-CTAB復(fù)合物。3.將離心管置于65℃的水浴中保溫40分鐘，期間每隔10分鐘目的：水浴使CTAB抽提液和葉片充分反應(yīng)。（三）抽提去掉蛋白質(zhì)1.將水浴的離心管取出，冷卻2分鐘后，加入1ml酚-氯仿-異戊醇，振蕩2分鐘，使兩者混合均勻，12000r/min離心10分鐘；目的：第一次離心溶液分3層，上-中-下層：CTAB-核酸-變性蛋白-有機(jī)溶劑2.取上清液（含CTAB-核酸）至新的10ml離心管中，加入2ml氯仿-異戊醇，輕輕顛倒離心管，混勻，12000r/min離心10分鐘。目的：第二次離心進(jìn)一步去掉變性蛋白，去掉多余的酚（四）沉淀核酸1.小心取上清液（含CTAB-核酸）置于一個(gè)新的10ml離心管中（盡量避免吸取中間層）,加入2.5ml的異丙醇（-20℃預(yù)冷），將離心管慢慢上下?lián)u動(dòng)30秒，使異丙醇與水層充分混合，室溫放置15分鐘至能見(jiàn)到DNA絮狀物目的：異丙醇為DNA沉淀劑，異丙醇與CTAB互溶，但不與核酸相溶。用-20℃預(yù)冷的異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好，異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當(dāng)，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會(huì)使部分核酸溶解損失；所以多選用-20度預(yù)冷異丙醇。核酸在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來(lái)沉淀更完全。異丙醇易溶于CTAB，但不與核酸相溶。2.10000r/min離心10分鐘,小心倒去上清液。目的：第三次離心使核酸沉淀到管底。（五）核酸的洗滌用400ul無(wú)水乙醇洗滌核酸沉淀直至無(wú)色，10000r/min離心10分鐘，傾去上清液晾干。目的：異丙醇不易揮發(fā)，所以用乙醇洗去異丙醇及多余的NaCl，乙醇揮發(fā)快。（六）保存向下層離心物中加入100μlTE緩沖液進(jìn)行溶解，置于-20℃冰箱目的：一般長(zhǎng)期保存DNA，貯存在TE緩沖液中比較好。TE為含EDTA的Tris-HCl(PH8.0)緩沖液：其中比較關(guān)鍵的成分是EDTA，日常環(huán)境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNaseI可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價(jià)錳離子存在條件下，DNaseI可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金屬離子，從而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩(wěn)定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA會(huì)影響下游酶切，連接反應(yīng)以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的效率，如果接下來(lái)要做這些實(shí)驗(yàn)是應(yīng)該避免使用含EDTA的緩沖液的。短期儲(chǔ)存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA連接等效果。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作；2.部分藥品有毒，操作中應(yīng)注意安全防護(hù)；3.磨樣時(shí)最好是加液氮，磨樣速度要快，使材料