天麻的活性成分研究及其質(zhì)量評(píng)價(jià)

天麻的活性成分研究及其質(zhì)量評(píng)價(jià)澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院汪潛【摘要】根據(jù)最新資料從天麻基源，化學(xué)成分，質(zhì)量評(píng)價(jià)三個(gè)方面對(duì)天麻進(jìn)行了考察。天麻屬植物在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6個(gè)品種，天麻總成分包括天麻素，天麻甙元等十幾種以及多糖類成分；不同產(chǎn)地，不同栽培條件，不同采收期，不同加工炮制方法對(duì)天麻的有效成分含量均產(chǎn)生影響；從真?zhèn)舞b別和含量測(cè)定兩個(gè)方面介紹了目前常用的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為今后對(duì)天麻質(zhì)量考察研究工作的深入開展提供了相關(guān)的依據(jù)和線索。【關(guān)鍵詞】天麻基源化學(xué)成分含量測(cè)定高效液相色譜毛細(xì)管電泳【Keywords】Gastrodiaelata;Origin;Chemicalconstituens;contentdetermination;HPLC;capillaryelectrphoresis天麻為蘭科植物GastrodiaelataBlu.的枯燥塊莖。性平、味甘、歸肝經(jīng)，具有熄風(fēng)、平肝、定驚的成效。實(shí)驗(yàn)證明具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、降壓、抗驚厥等作用，中醫(yī)臨床用于治療驚風(fēng)抽搐，風(fēng)濕，頭痛，眩暈，胸痹，癲癇等病[1]。50年代以來，我國藥學(xué)工作者對(duì)天麻的基源、人工栽培、植化、質(zhì)控、藥理、臨床等作都了系統(tǒng)的研究，隨著天麻研究的不斷深入，它的用途也越來越廣，本文就最新資料對(duì)天麻的基源，活性成分以及質(zhì)量控制等方面作一綜述。一、天麻的基源目前我國天麻屬植物已發(fā)現(xiàn)有6個(gè)品種，即天麻(G．elata)、原天麻(G．sn8usta)、細(xì)天麻(G．gracilis)、南天麻(C．javanica)、疣天麻(G．tuberculata)，臺(tái)灣省還分布一種Gflabilabella[2]。其中細(xì)天麻、南天麻主要分布在臺(tái)灣省，疣天麻在云南省中部地區(qū)發(fā)現(xiàn)，原天麻分布于云南省麗江、石屏及四川省峨媚的高山區(qū)。我國天麻分布區(qū)主要分布的是G．elata。天麻(G．elata)在我國普遍栽培，分布較廣，在種內(nèi)產(chǎn)生了許多變異，經(jīng)常可以看到花的顏色、花莖的顏色、塊莖的形狀、塊莖含水量不同的天麻。周鉉等曾根據(jù)以上特點(diǎn)，將天麻劃分為4個(gè)類型，即原變型—紅天麻(GelataB1．F．elata)、綠天麻(G．elataB1．F．ViridlsMalKino)、烏天麻(G．elataB1f．G1aucaSChow)、黃天麻(GelataB1ff1avidaSChow)[3]。在生產(chǎn)中栽培的主要是紅天麻和烏天麻。紅天麻也稱紅桿天麻，我國長江流域諸省、東北、西南及日本、朝鮮、前蘇聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)都有分布，我國陜西省漢中地區(qū)各縣，以及陜南、豫西、川北等地主要好生和栽培的是紅桿天麻，分布在海拔800—1500m的山區(qū)。烏天麻也稱烏桿天麻、鐵天麻，花莖灰褐色，帶有明顯的白色縱條斑?；S綠色，果實(shí)有棱、間隔淡黃綠與褐色條紋，為上粗下細(xì)的倒圓錐形。塊莖短柱形，前端有明顯的肩，淡黃色，最大者可達(dá)1000余克，含水量71%左右。我國東北長白山區(qū)有烏天麻生長，南方主要分布在海拔1500米以上的高山區(qū)，在高山區(qū)栽培的主要是烏桿天麻。除上述兩種天麻外，紅桿天麻分布地區(qū)?；焐贁?shù)綠桿天麻，花莖黃綠至藍(lán)綠色，花黃色，果卵圓形綠色，塊莖圓錐形，含水量介于紅桿與烏桿之間，是較稀有的栽培天麻。我國是世界上野生天麻分布的主要國家之一，主產(chǎn)于四川、云南、陜西、安徽、河南、遼寧、吉林、湖北、湖南、貴州、甘肅、西藏及臺(tái)灣等地。二、天麻的活性成分1.總成分1958年劉星楷等報(bào)道，從一麻塊莖中分出針狀結(jié)晶，經(jīng)鑒定為香莢蘭醇〔Vanillyalcohol〕[4]，但其它學(xué)者進(jìn)一步研究后未發(fā)現(xiàn)這一成分。1979年周俊等發(fā)現(xiàn)了天麻中含量較高的一個(gè)主要成分是1種新的酚甙，命名為天麻素〔Gastrodin〕,即對(duì)羥基苯甲醇－β－D葡萄吡喃糖甙〔P－Hdroxyethylphenyl-B-D-glucopyranoside〕[5]。1981年TaguchiH等報(bào)道1種新的甙類稱為Grastrodioside,為一種雙〔4羥芐基醚、單氧－B－D吡喃葡萄糖〔Bis(4-Hydroxybenzyl)ethermono-B－lucopyranoside〕以及2種首次在天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分：4－〔4－羥芐基氧〕芐基甲醚［4－〔4－Hydroxybenzyloy〕methylether］和雙〔4－羥芐基〕醚Bis(4-hydroxybenzyl)ether〕[6],后者周俊等已有報(bào)道。同時(shí)還別離到另一種酚性化合物，4－羥基芐基甲醚〔p-Hydroxybenzylmethylether〕[7]。胡忠等從天麻球莖中別離并純化衛(wèi)種抗真菌蛋白〔Gasrtodinantifungalprotein〕簡稱GAFP,每1kg鮮球莖中可分得GAFP約20mg,用SDS—PAGE和凝膠過濾層析測(cè)得該蛋白為單多肽鏈，分子量14．OKD，用離子交換結(jié)合法測(cè)得等電點(diǎn)為8．1，是一種堿性蛋白，富含天冬酰胺(25mol／mol蛋白)、甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸，但未檢出蛋氨酸、脯氨酸和半胱氨酸，紫外吸收入M＝278nm。在天然狀態(tài)下，GAFP與考馬氏藍(lán)試劑不發(fā)生顯色反響，具這一性質(zhì)的蛋白質(zhì)文獻(xiàn)中還未見報(bào)道[8]。GAFP無幾丁質(zhì)酶和9—l，3—葡聚糖酶活性，說明GAFP并不屬于消化真菌細(xì)胞壁的酶類。天麻是真菌寄生植物，不含葉綠素，蜜環(huán)菌侵入初生球莖并在皮層中被消化，營養(yǎng)物質(zhì)供次生球莖生長的需要，楊增明等從初生球莖中別離并純化了幾丁質(zhì)酶和9—l，3—葡聚糖酶，分子量各為31．5KD和94KD，得率約為0．8和0．4mg／100g鮮重。這兩種酶對(duì)平板上培養(yǎng)的木霉菌絲的生長均有抑制作用，被認(rèn)為在天麻初生球莖消化蜜環(huán)菌菌絲過程中起重要作用。除上述成分外，天麻塊莖中還含—谷笛醇、胡蘿卜甙、檸檬酸、棕?cái)R酸、琥珀酸等。微量元素以FG含量最高，F(xiàn)、Mn、Zn、1次之[9]。2.天麻中多糖類化合物胡梅清等從生產(chǎn)天麻注射液后的殘?jiān)蟹值冒咨勰畹奶炻閯蚨嗵?，?jīng)檢測(cè)本品不含酸性多糖和雜多糖，而是由葡萄糖分子組成的勻多糖[10]。天麻中除己分得蔗糖外，又報(bào)道從天麻中分出三種雜多糖：GE—I，GE—II，GE—III，均為白色粉末，元素分析不含氮，經(jīng)紙上電泳和凝膠柱層析，證明為單一組分。GE—I：分子量3000；GE—II：3100，[a]＋17l。；GE—III：22lO[a]＋162．96。。三種雜多糖經(jīng)水解和紙色譜分析主要為葡萄糖組成，制備乙酰衍生物進(jìn)行氣相與單糖乙酰物比擬和計(jì)算，結(jié)果得出三種多糖的組成及克分子比是：GE—I組成是葡萄糖：甘露糖：木糖：阿拉伯糖＝70：1：0．5：0．3；GE—II是葡萄糖：甘露糖＝19：1，GE—III是葡萄糖及微量甘露糖，三種多糖均具有細(xì)胞免疫活性[11]。3.不同產(chǎn)地天麻有效成分含量的變化周俊等報(bào)道了不同產(chǎn)地藥用天麻和天麻屬中少數(shù)品種中的9種酚性成分：1)天麻索，2)對(duì)羥基苯甲醇，3)對(duì)羥基苯甲醛，4)3，4-二羥基苯甲醛，5)4，4-二羥基二苯基甲烷，6)4，4’-二經(jīng)基二芐醚，7)對(duì)羥基乙基醚，8)4-乙氧甲苯基-4’-羥基醚，9)三[4-(9-D-葡萄吡喃糖基)-氧-節(jié)基]-檸檬酸酯[12]。測(cè)試結(jié)果說明，東北道化和云南昭通的藥用天麻所含酚性成分根本上是一致的；原天麻中只檢出l，2，3，其中2和3是酚性成分中結(jié)構(gòu)最簡單者，據(jù)測(cè)原天麻可能是天麻屬中的原始類型，藥用天麻可能是進(jìn)化類型，并與形態(tài)比擬的植物分類學(xué)觀點(diǎn)很吻合。河南省為全國天麻主產(chǎn)地之一，沙振方等采用HPLC方法檢出18份天麻樣品中天麻素含量。結(jié)果說明這些樣品中天麻素的含量為O．17—1．O%，平均含量為O．46%，其差異可能由干存放時(shí)間、加工炮制、采收季節(jié)、生長環(huán)境等的影響[13]。王桂英對(duì)四川省5個(gè)產(chǎn)區(qū)購置的商品天麻采用薄層分光光度法測(cè)定天麻素、天麻貳元含量，按藥典方法測(cè)定天麻成品中的水分含量，說明各地商品的質(zhì)量有差異,生藥等級(jí)并不能淮確地代表質(zhì)量[14]。4.不同栽培條件對(duì)天麻有效成分含量的影響天麻在不同栽培條件下其有效成分有一定差異，曾有報(bào)道，用天麻注射液的含量測(cè)定方法，對(duì)室內(nèi)家種天麻和野生品比擬，以及不同海拔高度野生天麻質(zhì)量比擬，說明在平原、丘陵或室內(nèi)培植天麻其有效成份并不低于野生品種[15]。但用HPLC方法，測(cè)定貴州省野生與家種天麻中天麻素的含量，結(jié)果10份野生天麻中天麻素含量在0．5～1．0%之間，家種天麻天麻素含量那么明顯高于野生天麻[16]。天麻人工栽培時(shí)培養(yǎng)蜜環(huán)菌一般多用小葉青崗等樹種，為了擴(kuò)大菌材的樹種，曾研究了14種樹種作為菌材使用。有(1)小葉育崗，(2)法國梧桐，(3)烏柏，(4)槐樹，(5)柳樹，(6)桃樹，(7)，馬尾松,(8)黃檀，(9)白毛楊，(10)桑樹，(11)梢樹，(12)沙梨，(12)楓香樹，(14)楓楊。結(jié)果以小葉青崗、楓楊、黃檀、法國梧桐、柳樹為菌材栽培的天麻生長情況較好。從薄層定性檢查發(fā)現(xiàn)14種樣品所含的成分未見差異，但天麻貳的含量有較大差異。研究說明，多種樹種可作菌材，并不限于小葉青崗。5.不同采收期對(duì)天麻有效成分的影響對(duì)不同采收期天麻中天麻貳的含量測(cè)定，結(jié)果說明不同收獲期的天麻中天麻甙的百分含量有較大差異，7月份為0．93～O．03％，9月份為0．3l～O．0l％，l2月份為O.23～O．01％，其中以7月份采收的天麻甙含量最高為傳統(tǒng)收獲期〔12月份〕的3倍[17]。對(duì)不同采挖期(11月至翌年6月，每月取樣)家種和野生天麻中大麻素、天麻甙元進(jìn)行比擬研究發(fā)現(xiàn)，天麻以11月至翌年4月收獲為好。6.不同加工炮制方法對(duì)天麻中有效成分的影響采用HPLC方法測(cè)定貴州省嚴(yán)的天麻中天麻素含量，凡新鮮天麻經(jīng)過除去表皮(或因挖掘時(shí)損傷塊莖)，不管煮法或蒸法加工品，其天麻素含量均有降低，而原皮蒸法加工者含量一般較高，這與天麻素易溶于水有密切關(guān)系。天麻經(jīng)不同加工處理后天麻素和天麻甙元的含量，結(jié)果以煮法加工為好，煮5～10分鐘為宜。如用蒸法，應(yīng)嚴(yán)格控制時(shí)間。如鮮品不經(jīng)殺酶處理，直接切片枯燥，成品率及有效成分含量均較低。天麻的加工炮制方法，除用水煮或蒸外，還有用于熱炮制方法進(jìn)行加工。丁敖林曾對(duì)天麻的3種炮制方法(浸潤法、干熱法、蒸軟法)進(jìn)行了比擬，采用分光光度法檢測(cè)天麻經(jīng)3種不同方法炮制后天麻素的含量。認(rèn)為干熱法較其它兩種方法為優(yōu)，工藝簡單，周期短，成品率高，天麻素含量不下降。蔣禮年等曾對(duì)天麻不同切制方法進(jìn)行了比擬，并用分光光度法檢測(cè)其天麻素的含量。認(rèn)為蒸切法較好，天麻素含量高[18]。測(cè)定天麻不同加工方法和未經(jīng)加工天麻中天麻素和甙元含量。結(jié)果說明：加工后天麻中天麻素含量顯著高于末加工天麻中天麻素的含量，而甙元含量卻顯著低于未加工者。三、天麻的質(zhì)量評(píng)價(jià)天麻的質(zhì)量評(píng)價(jià)可以從真?zhèn)蔚蔫b別和含量測(cè)定兩個(gè)方面去考察。目前，常用的鑒別方法有經(jīng)驗(yàn)鑒別，顯微鑒別，理化鑒別和薄層色譜法；天麻素是天麻的主要成分，含量高達(dá)0.33～0.67％[19]，考察天麻的質(zhì)量多以天麻素為指標(biāo)，就目前來說其含量測(cè)定的方法一般為高效液相色譜法，反相高效液相色譜法，紫外分光光度法，薄層色譜法，薄層掃描以及二階導(dǎo)數(shù)光譜法，其中以高效液相色譜法〔HPLC〕最為多見。1.鑒別1.1經(jīng)驗(yàn)鑒別由于天麻是與蜜環(huán)菌共生,所以天麻有如下主要特征:塊莖兩端無根須,一端有從母體脫落遺留的圓臍痕,一端有紅棕色至深棕色干芽苞稱“鸚哥嘴＂。鮮品體形呈長橢圓形,干后扁縮稍彎曲,外表黃白色或淡黃棕色,多縱行皺紋及由潛伏芽排列而成的橫環(huán)紋和鞘狀鱗片,有時(shí)可見附著的棕褐色蜜環(huán)菌絲;質(zhì)地堅(jiān)實(shí),斷面平坦,半透明角質(zhì)樣,氣味特異香,嚼之不粘牙,味甘微辛,春麻幼嫩,母麻有較大空腔。常見的偽品有紫茉莉、大麗菊、馬鈴薯、多花黃精、羊角天麻、綠天麻、硬毛地筍、豆薯,它們雖有某些相似處,但不具有天麻的典型特征。1.2顯微鑒別天麻塊莖橫切面最外層有殘留的表皮,細(xì)胞呈切向延長,皮層為10數(shù)列多角形細(xì)胞,有草酸鈣晶束。中柱散在周韌型維管束,2至數(shù)個(gè)導(dǎo)管成群,薄壁細(xì)胞亦含針晶束。粉末呈米黃色或淡黃棕色,薄壁細(xì)胞中可見充滿長卵形、長橢圓形顆粒,草酸鈣針晶多成束存在其中;木化厚壁細(xì)胞呈多角形或類橢圓形,紋孔明顯,或散在的類長方形厚壁細(xì)胞,紋孔不明顯。螺紋、網(wǎng)紋及環(huán)紋導(dǎo)管,含粘液質(zhì)或黃棕色塊狀物。1.3理化鑒別取天麻粉末1ｇ,加水10ｍｌ,浸4ｈ,振搖過濾,濾液加碘試液2～4滴,呈紫紅色或酒紅色,加45%乙醇10ｍｌ,浸4ｈ過濾,濾液加硝酸汞試劑0.5ｍｌ,加熱,溶液呈玫瑰紅色,并發(fā)生黃色沉淀。偽品試驗(yàn)與此不同。1.4薄層色譜鑒別取樣品粉末0.2ｇ,加70%乙醇1ｍｌ,振搖,放置4ｈ,取上清液點(diǎn)于硅膠Ｇ板上,點(diǎn)樣基線距底邊2.5cm,樣點(diǎn)圓形,直徑不超過3ｍｍ,點(diǎn)間距1.5～2ｃｍ。以氯仿/甲醇(9︰1)為展開劑,展距18ｃｍ,用10%磷鉬酸無水乙醇噴霧,于110℃烘烤5～10min,天麻苷顯紫紅色斑點(diǎn),,天麻苷元顯紫紅色斑點(diǎn)[20]。2.含量測(cè)定藥典方法[21]色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：用八〔或十〕烷基硅烷健合硅膠為填充劑；甲醇－磷酸鹽溶液〔含磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉各為0.1mol/L〕－水(1.5:3:95.5)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為270nm。理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。對(duì)照品溶液的制備：精密稱取天麻素對(duì)照品〔80℃枯燥1小時(shí)〕25mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，〔每1ml中含天麻素1mg〕。供試品溶液的制備：精密稱取經(jīng)80℃枯燥后的本品粉末0.5g，置10ml量瓶中，精密加甲醇5ml,超聲處理30分鐘后，靜置24小時(shí)，振搖后再超聲處理15分鐘，搖勻，靜置。取上清液離心，即得。測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液5μl與供試品溶液5～10μl,注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品按枯燥品計(jì)含天麻素(C12H10O)不得少于0.10％。改進(jìn)的高效液相色譜法對(duì)照品溶液：精確稱取天麻素對(duì)照品(80℃枯燥1ｈ)10ｍｇ,置10ｍl容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1ｍl中含天麻素1ｍｇ)。供試品溶液的制備：精確稱取經(jīng)80℃枯燥后的天麻樣品粉末約1.0ｇ,置10ｍl容量瓶中,精確參加甲醇5ｍl,稱定重量,超聲處理30ｍｉｎ,靜置24ｈ,振搖后再超聲處理15ｍｉｎ,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,靜置。取上清液離心,并用4μｍ濾膜過濾,即得。最大吸收波長的選擇：取對(duì)照品溶液,用流動(dòng)相稀釋后,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定,測(cè)得天麻素最大吸收波長為279ｎｍ、270ｎｍ、221ｎｍ,本試驗(yàn)選定270ｎｍ為測(cè)定波長。天麻素的吸收波長譜見圖1。色譜條件：色譜柱:Ｃ18中科院大連物化所(200ｍｍ×4.6ｍｍ,10μｍ);柱溫:室溫;流動(dòng)相:甲醇：水(30：70);流速:2.0ｍl/ｍｉｎ;紙速:5ｃｍ/ｍｉｎ;檢測(cè)波長:270ｎｍ;保存時(shí)間:7.6～7.8ｍｉｎ。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液1,2,3,4,5,6,7,8μl,按上述色譜條件測(cè)定,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Ｙ=95980Ｘ+2828,ｒ=0.9999。天麻素在1.20～12.50μｇ范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC圖譜見圖2、圖3。穩(wěn)定性試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液5μl,間隔一定時(shí)間進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣5次,天麻素的RSD=1.42%。說明樣品溶液在48ｈ內(nèi)穩(wěn)定。穩(wěn)定性結(jié)果見表1。重復(fù)性試驗(yàn)：對(duì)同一批樣品(Ⅰ),分別稱樣5次,照3.2法處理,測(cè)定天麻素含量,結(jié)果見表2。精密度試驗(yàn)：吸取對(duì)照品溶液5μL,重復(fù)樣品5次,5次測(cè)得峰面積值的RSD=1.11%,結(jié)果見表3。樣品的含量測(cè)定：取3個(gè)產(chǎn)地的各2批天麻樣品,共計(jì)6批,按3.2法處理,制成供試液。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品液5μl、供試品液10μl,在上述色譜條件下進(jìn)樣和測(cè)定,按照枯燥品計(jì)算樣品中天麻素含量,測(cè)定結(jié)果見表4?；厥章试囼?yàn)：《中國藥典》2000年版中天麻素作為控制天麻質(zhì)量主要定量指針,已進(jìn)行了收載。本試驗(yàn)的測(cè)定方法與藥典方法相比擬在流動(dòng)相配制的簡便性和對(duì)色譜柱的保護(hù)等方面有一定的優(yōu)越性,防止了長期使用緩沖液流動(dòng)相對(duì)色譜柱柱效的影響[22]。2.3高效液相色譜別離/蒸發(fā)光散射和紫外檢測(cè)法蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)作為一種半通用型質(zhì)量檢測(cè)器，可用于檢測(cè)類酯、糖等物質(zhì)。近年來，在對(duì)天然藥物的檢測(cè)方面應(yīng)用得也越來越多，如對(duì)人參皂甙和銀杏內(nèi)酯的檢測(cè)等。用HPLC/ELSD測(cè)定天麻甙尚未見報(bào)道[23]。正相HPLC和反相HPLC都可用于天麻及其制劑中天麻甙的別離，本試驗(yàn)采用紫外檢測(cè)法，檢測(cè)波長在20nm或270nm處。色譜條件：ELSD和DAD檢測(cè)均使用同樣的色譜條件。色譜柱：ZorbaxRX-SIL[4.6mm(i.d.)×25cm,5μm]硅膠柱(HP公司產(chǎn)品),配有預(yù)柱MicroPakSI-5[4mm(i.d.)×4cm,5μm]硅膠柱(Parker公司產(chǎn)品)。流動(dòng)相：正己烷/甲醇/乙酸乙酯(體積比6：3：2),流速0.8mL/min;進(jìn)樣量20μL.ELSD參數(shù)：漂移管溫度65℃,氮?dú)饬魉?.55L/min;DAD檢測(cè)波長270nm。樣品處理：將天麻枯燥塊莖粉碎后,準(zhǔn)確稱取100g。用70%的乙醇水溶液熱回流3次，每次回流后再用超聲提取。將提取液過濾后進(jìn)行濃縮,濃縮液用甲醇稀釋至適當(dāng)濃度,放入冰箱內(nèi)冷凍。澄清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后直接進(jìn)行HPLC分析。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取89.0mg和21.3mg的天麻甙溶于100mL甲醇中,配制成兩個(gè)儲(chǔ)藏液。使用前以甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的工作溶液。天麻甙的別離：天麻的乙醇提取物中成分很多.當(dāng)流動(dòng)相正己烷/甲醇/乙酸乙酯的體積比為5:3:2時(shí),從DAD檢測(cè)的色譜圖(圖1)可見,各種物質(zhì)已經(jīng)得到了較好的別離,但從ELSD檢測(cè)色譜圖(圖2)上發(fā)現(xiàn),天麻甙峰左側(cè)有肩峰,說明有弱極性物質(zhì)與天麻別離不完全,只是該物質(zhì)在270nm處無紫外吸收.增大正己烷比例,當(dāng)正己烷/甲醇/乙酸乙酯的體積比到達(dá)6：3：2時(shí),無論從DAD檢測(cè)結(jié)果[圖1(B)],還是ELSD檢測(cè)結(jié)果[圖2(B)]來看,提取物中的天麻甙與其它成分完全別離.從圖1(B)可知,天麻提取物中的天麻甙元和對(duì)羥基苯甲醛與其后相鄰的其它組分的別離不完全,本方法的重點(diǎn)是比擬ELSD和DAD檢測(cè)天麻甙,故未對(duì)其它組分的別離條件進(jìn)行優(yōu)化.繼續(xù)增大正己烷的比例,各組分之間的別離程度可進(jìn)一步提高,但將導(dǎo)致分析時(shí)間過長。Fig.11.4-Hydroxybenzylalcohol;2.4-hydroxybenzaldehyde;3.Gastrodin.Fig.21.Gastrodin;2.unknown.天麻甙可以使用反相條件進(jìn)行別離.我們采用ZorbaxSB-C18(4.5mmi.d.×25cm,5μm)色譜柱,水(含0.02mol/LKH2PO4)/甲醇(體積比65：35)為流動(dòng)相,使用DAD檢測(cè),成功地從天麻的乙醇提取物中別離并定量了天麻甙、天麻甙元和對(duì)羥基苯甲醛.對(duì)于ELSD檢測(cè),首要條件是要使流動(dòng)相根本揮發(fā),由于反相條件下流動(dòng)相中含水較多,即使不參加KH2PO4添加劑,在ELSD工作時(shí)相應(yīng)的漂移管溫度和氮?dú)鈿馑俣驾^高(95℃,2.7L/min),大大降低了天麻甙的檢測(cè)靈敏度.應(yīng)選用正相色譜條件來別離天麻甙.由于天麻甙元和對(duì)羥基苯甲醛的揮發(fā)性較大,即使在正相色譜條件下,也幾乎不能被ELSD檢測(cè)。ELSD條件優(yōu)化：通過改變漂移管溫度和氮?dú)饬魉?選定在較小噪音水平上產(chǎn)生最大檢測(cè)響應(yīng)值的條件為:漂移管溫度65℃,氮?dú)饬魉?.55L/min。線性關(guān)系考察：將貯備液稀釋配成濃度在21.3～890mg/L范圍內(nèi)的一系列待測(cè)溶液,依次進(jìn)樣20μl,根據(jù)ELSD和DAD測(cè)得的峰面積對(duì)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸.將最小濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液再逐級(jí)稀釋,依次進(jìn)樣20μL,計(jì)算當(dāng)信噪比為3時(shí),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度以確定檢出下限.結(jié)果列于表1.天麻樣品的測(cè)定：對(duì)同一份樣品重復(fù)進(jìn)樣5次,用ELSD和DAD測(cè)定其峰面積,取5次測(cè)定平均值計(jì)算樣品中天麻甙含量.在樣品溶液中參加量的天麻甙標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)定其回收率(見表2).ELSD和DAD檢測(cè)的比擬：ELSD和DAD作為兩種不同類型的檢測(cè)器,其適用范圍并不完全相同.DAD所能檢測(cè)的物質(zhì)必須具有紫外吸收,而所采用的流動(dòng)相那么應(yīng)在檢測(cè)波長下無紫外吸收.對(duì)于一些無紫外吸收的物質(zhì),可以通過衍生化的方法接上生色團(tuán).ELSD要求被測(cè)物應(yīng)當(dāng)比流動(dòng)相難于揮發(fā),對(duì)于一些半揮發(fā)性的物質(zhì),其檢測(cè)靈敏度很低.同時(shí),也應(yīng)盡量防止使用高沸點(diǎn)的溶劑作為流動(dòng)相.對(duì)于一些別離中常參加的添加劑,如乙酸鹽和磷酸鹽等,利用ELSD檢測(cè)時(shí)應(yīng)用易揮發(fā)的鹽來代替.使用DAD和ELSD同時(shí)檢測(cè),不僅可獲得更多的物質(zhì)信息,還可獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果[24].2.4毛細(xì)管電泳法儀器與設(shè)備：美國Waters公司生產(chǎn)的高效毛細(xì)管電泳儀,內(nèi)設(shè)恒溫系統(tǒng)和固定波長紫外檢測(cè)器。未涂層熔硅彈性石英毛細(xì)管,內(nèi)徑75μm,柱長60cm,有效柱長52cm。PH-3C型酸度計(jì)。紫外檢測(cè)波長設(shè)在214nm,檢測(cè)靈敏度為0.005。數(shù)據(jù)采集和處理由WatersMillennium2023色譜軟件完成。樣品溶液的制備：精密稱取天麻樣品粉末,分別以蒸餾水和70%乙醇經(jīng)冷浸提取48h,精密稱取商陸、黃精、天花粉和大九股牛粉末,分別以蒸餾水冷浸提取48h,各提取液經(jīng)過濾后備用。稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品,用10mL雙蒸水溶解備用。電泳操作：實(shí)驗(yàn)前,毛細(xì)管首先在室溫下用鉻酸洗液清洗毛細(xì)管。每次進(jìn)樣前分別用0.1mol/L的NaOH溶液和雙蒸水各沖洗4min,再用背景緩沖溶液沖洗4min。樣品采用重力進(jìn)樣,進(jìn)樣時(shí)間為5s.電泳條件的選擇：天麻中含有天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香草醇、香草醛等有效成分,其中,天麻素的含量較高,因此本文選擇天麻素作為真?zhèn)舞b別的參考標(biāo)準(zhǔn)。為使天麻素與天麻中的其它成分別離開來,分別考察了硼酸鹽的濃度、緩沖溶液的pH值、操作電壓對(duì)其別離的影響,最后確定24mmol/L硼酸鹽,pH值為9.4,運(yùn)行電壓為16kV作為鑒別和測(cè)定的條件。天麻中天麻素的測(cè)定：精密吸取一定體積的天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液,加水稀釋配成不同濃度,以校正峰面積對(duì)濃度作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果,天麻素在0.0224～0.448mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,線性相關(guān)方程為Y=-0.048+7.79X(r=0.999)。天麻水提取液中天麻素的含量(g/g)為0.212%,RSD=1.78%(n=5),回收率為100.2%;天麻乙醇-水提取液中天麻素的含量(g/g)為0.219%,RSD=2.97%(n=5),回收率為99.0%。兩種提取方法所獲得的結(jié)果一致。利用毛細(xì)管電泳測(cè)定天麻素的含量具有樣品處理簡單、操作簡便、快速的特點(diǎn)，該方法亦可以用于天麻真?zhèn)蔚蔫b定[25]。近年來對(duì)天麻的栽培，化學(xué)成分，質(zhì)量控制方法的方面的研究仍在不斷的深入，對(duì)研究中出現(xiàn)的問題，比方天麻種類的變異，天麻的化學(xué)結(jié)構(gòu)，藥理作用機(jī)制等等，也有了新的進(jìn)展，為天麻合理準(zhǔn)確有效的應(yīng)用于臨床奠定了良好的根底。同時(shí)，問題依然存在，比方說天麻素是否為天麻的有效成分仍有爭(zhēng)議，天麻素于天麻的作用是否完全吻合，天麻中是否還有其他的活性成分，還有哪些微量元素，如何能找到更好的天麻質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法，還有待進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)FENGXiao-Zhang(馮孝章),CHENYu-Wu(陳玉武),YANGJun-Shan(楊峻山).ActaChimicaSinica(化學(xué)學(xué)報(bào))[J],1979,37(3):175—182ZHOUJun(周俊),PUXiang-Yu(浦湘渝),YANGYan-Bin(楊雁賓).ChineseScienceBulletin(科學(xué)通報(bào))[J],1981,26(18):1118—1120HUANGJun-Hua(黃俊華),WANGGui-Lian(王桂蓮).ActaAcedemiaeMedicinaeSinicae(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào))[J],1985,7(5):399—402TONGChun-Yan(童春燕).ChineseJ.PharmaceuticalAnalysis(藥物分析雜志)[J],1989,9(3):182—183WANGYue-Sheng(王躍生),LIJi-Ping(李計(jì)萍),LIUShu-Zhi(劉淑芝)etal..ChinaJ.ChineseMateriaMedica(中國中藥雜志)[J],1998,23(9):541—543MarcatoB.,CecchinG..J.Chromatogr.A[J],1996,730:83—90ClementA.,YongD.,BrechetC..J.Liq.Chromatogr.[J],1992,15(5):805—817ParkM.K.,ParkJ.H.,HanS.B.etal..J.Chromatogr.A[J],1996,736: