食品微生物檢測基礎(chǔ)

食品微生物檢測基礎(chǔ)食品微生物簡介１微生物的概念２微生物包括的種類３病原微生物的概念４微生物的特性５細(xì)菌的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)

微生物的定義：是一群形體細(xì)小、結(jié)構(gòu)簡單、人肉眼看不見，必須借助于光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡放大幾百倍、幾千倍甚至幾萬倍才能看到的生物。微生物包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌、螺旋菌、立克次氏體、衣原體、病毒及微藻類等。病原微生物定義：

大部分微生物是有益的，只有小部分微生物是有害的，可以引起各種疫病，這部分微生物叫做病原微生物．

微生物的特性1個體微小，結(jié)構(gòu)簡單2分布廣，種類多3繁殖快，數(shù)量大4易于變異，適應(yīng)力強5易于培養(yǎng)，代謝活力強細(xì)菌的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)

１細(xì)菌是一種具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞生物.２細(xì)菌的大小以微米（μm）為測量單位（一微米等于千分之一毫米）。３根據(jù)細(xì)菌形態(tài)一般分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類。４細(xì)菌具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核糖體和內(nèi)含物等基本結(jié)構(gòu)。５細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)有莢膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。食品微生物檢測所涉及的類群微生物非細(xì)胞生物細(xì)胞生物病毒原核生物真核生物細(xì)菌酵母菌、霉菌微生物檢測程序

樣品的采集注意：1所用接觸樣品的用具經(jīng)過滅菌2取樣要均勻、特殊樣品要控制溫度3樣品采好后要貼上標(biāo)簽（注明：樣品名稱、來源、數(shù)量、采樣人、地點及時間）樣品的微生物檢驗注意：1采好的樣品送檢不要超過3小時2檢完的樣品的存放時間3報告的填寫

菌落總數(shù)的測定首先要明白菌落的定義。菌落的定義：將細(xì)菌劃線接種在固體培養(yǎng)基上經(jīng)18∽24小時培養(yǎng)，長出肉眼可見的有單一細(xì)菌生長繁殖而成的細(xì)菌集團(tuán)。菌落總數(shù)：食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1ml（g）檢樣中所含菌落的總數(shù)。1、設(shè)備和材料：

（見書151頁）

2、培養(yǎng)基和試劑：營養(yǎng)瓊脂75％乙醇稀釋劑：0.85％生理鹽水菌落總數(shù)的檢驗程序25g(ml)樣品+225ml生理鹽水(1:10的稀釋液)作幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液(例如1:100，1:1000)選擇2~3個適宜稀釋度各取1ml分別加入滅菌培養(yǎng)皿中每個平皿中加適量（15~20ml）營養(yǎng)瓊脂菌落記數(shù)

（二）菌落計數(shù)方法做平板菌落計數(shù)，用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏，記下各平板菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各個平板平均菌落數(shù)。

（三）菌落計數(shù)的報告1、平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)。2、稀釋度的選擇（見下表）

例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（個/g或個ml）報告方式（個/g或ml）10-1

10-2

10-3

1多不可計16420—1640016000或1.6×104

2多不可計295461.63775038000或3.8×104

3多不可計271602.22710027000或2.7×104

4多不可計多不可計313—313000310000或3.0×105

527115—270270或2.7×102

6000—1<10

<10

7多不可計30512—3050031000或3.1×104

三、菌落數(shù)的報告1、菌落數(shù)在100以內(nèi)的按其實有數(shù)報告。2、菌落數(shù)大于100的采用兩位有效數(shù)字，有效數(shù)字后面的數(shù)值采用四舍五入計算。3、結(jié)果也可以用10的指數(shù)表示。

注意事項：1操作要在無菌的狀態(tài)下進(jìn)行。2操作時間越短越好。3樣品不同選擇的稀釋倍數(shù)不同。4培養(yǎng)基冷卻溫度不宜過高或過低。霉菌和酵母菌的計數(shù)1、設(shè)備和材料：

（同細(xì)菌總數(shù)測定）2、培養(yǎng)基和試劑：孟加拉紅培養(yǎng)基滅菌蒸餾水霉菌和酵母菌的檢測程序25g(ml)樣品+225ml無菌水作幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇3個適宜稀釋度，各以1ml的量加入滅菌平皿內(nèi)每個平皿內(nèi)加入適量培養(yǎng)液約20ml左右菌落計數(shù)

菌落計數(shù)及報告：

1、選擇菌落數(shù)在10~150之間的平板進(jìn)行菌落計

數(shù)。

2、其他同菌落總數(shù)一樣。

注意事項：1、培養(yǎng)溫度是在25℃~28℃，培養(yǎng)時間是5天。2、在往平皿中加培養(yǎng)基時應(yīng)多加一些。（當(dāng)培養(yǎng)基自然漫過平皿底部時再多加一點）大腸菌群的測定一、大腸菌群MPN的概念及意義大腸菌群系指一群在37℃24小時能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以次作為糞便指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。

培養(yǎng)基和試劑：

乳糖膽鹽發(fā)酵管

伊紅美藍(lán)瓊脂平板

乳糖發(fā)酵管

0.85％生理鹽水

革蘭氏染色液大腸菌群的檢驗程序：

注意事項：

1.乳糖膽鹽發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管在滅菌以后要檢查小導(dǎo)管內(nèi)有無氣泡,如果有氣泡就不能再用了。

2.計算產(chǎn)氣管的數(shù)量時以乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣管的數(shù)量為準(zhǔn)。

3.從伊紅美藍(lán)瓊脂平板上挑細(xì)菌接種乳糖發(fā)酵管和進(jìn)行革蘭氏染色時一定要挑取典型菌落，無典型菌落時要多挑幾個菌落。實驗室生物安全基本知識微生物實驗室玻璃器皿的準(zhǔn)備一、洗滌載玻片和蓋玻片在清洗前可先在2%鹽酸溶液中浸泡1h。二、滅菌前的準(zhǔn)備

制作棉塞包扎器皿滅菌微生物培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的定義：是根據(jù)細(xì)菌的生長需要人工配置的營養(yǎng)環(huán)境。按物理性狀分類可分為液體、半固體、固體培養(yǎng)基。按用途分類可分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基。稱出一定量粉狀培養(yǎng)基→加適量的水溶解→分裝→滅菌→檢定→保存

消毒與滅菌一、干熱滅菌法1.火焰滅菌（酒精燈）2.干熱滅菌（電熱干燥箱）二、濕熱滅菌法1.煮沸消毒2.流通蒸汽滅菌3.巴氏消毒4.加熱蒸汽滅菌法（高壓滅菌鍋）消毒滅菌的基本概念1.滅菌：殺滅物體中所有微生物的繁殖體和芽胞的方法。2.消毒：殺死病原微生物的方法。3.防腐：防止或阻止微生物生長繁殖的方法。4.無菌：不含有活的微生物的意思。5.無菌技術(shù)（無菌操作）：防止微生物進(jìn)入機體或物體的方法。顯微鏡的構(gòu)造

A、機械部分：顯微鏡的機械裝置是顯微鏡的重要組成部分。機械裝置的作用是固定及調(diào)節(jié)光學(xué)鏡頭，固定與移動標(biāo)本等。只有良好的機械裝置，顯微鏡才能充分發(fā)揮作用。顯微鏡的機械裝置由各種精密零件組成。

（1）鏡座：它是顯微鏡的底座，一般為馬蹄形，作用是支撐整個顯微鏡。有的顯微鏡座內(nèi)裝有照明光源和反射鏡。（2）鏡柱：聯(lián)系于鏡座和鏡臂之間，有支持顯微鏡其他部分的作用。（3）鏡臂：一般為彎柄形，拿取顯微鏡時握此臂。鏡臂與鏡柱之間有關(guān)節(jié)相連，可以作適當(dāng)?shù)膬A斜，以便觀察。有些顯微鏡的鏡臂與鏡柱之間沒有關(guān)系，不能做任何角度的傾斜。鏡臂有持鏡筒、鏡臺、照明裝置及調(diào)節(jié)焦距裝置等作用。

（4）調(diào)節(jié)器：為了得到清晰的物象，必須調(diào)節(jié)物鏡和標(biāo)本之間的距離，使它與物鏡的工作距離相等。這種操作叫做調(diào)焦。在鏡臂上方（各鏡位置不一樣，有的一個在上方，一個在下方），有大小兩種螺旋，一般向前方轉(zhuǎn)動時，鏡筒下降，向后方轉(zhuǎn)動時鏡筒上升；但也有顯微鏡，轉(zhuǎn)動時鏡柱下降；也有些顯微鏡在轉(zhuǎn)動螺旋時，鏡筒不變，而鏡臺上下升降。

。大螺旋（粗調(diào)節(jié)）可使鏡筒作較大距離和較快速度的上升或下降，通常在使用低倍鏡時，用大螺旋調(diào)節(jié)，能迅速找到物景。小螺旋（細(xì)調(diào)節(jié)）可使鏡筒緩慢地上升或下降，可以作精細(xì)的調(diào)節(jié)，使物象更加清晰。此外，在鏡柱附近還有一個聚光鏡螺旋，可以使聚光鏡上升或下降

（5）鏡筒：鏡筒是由金屬制成的圓筒，上端放置目鏡，下端連接物鏡。鏡筒內(nèi)壁，為了避免光線的亂反射，噴上黑色無光漆。筒長度一般為155~250毫米，常用的為160或170毫米。國產(chǎn)顯微鏡通常是160毫米。（6）物鏡轉(zhuǎn)換器（回轉(zhuǎn)盤）：固定在鏡筒下端。它有3~4個物鏡螺旋口，呈盤狀。根據(jù)需要放大倍數(shù)不同，可調(diào)換不同放大倍數(shù)的物鏡鏡頭。

（7）載物臺：也叫工作臺或鏡臺。它的作用是安放載玻片。載物臺中心有一個通光孔，通光孔后方左右側(cè)各有一個安裝片夾用的小孔。載物臺由上下兩片組成，上面一片裝有旋鈕，可向左右移動；下面一片通過旋鈕可使上面一片前后移動。載物臺的縱橫坐標(biāo)都裝有游標(biāo)尺，既能固定標(biāo)本，又能使之前后移動，以便尋找物象。

B、光學(xué)部分：（1）目鏡：因為它靠近觀察者的眼睛，因此也叫接目鏡。目鏡安裝在鏡筒的上端。各種目鏡的口徑尺寸都是統(tǒng)一的，根據(jù)需要可以互換使用。目鏡只起放大的作用，并不增強顯微鏡的分辨力。一般有2~4個，放大功率各不相同。鏡的圓筒上面刻有放大率，如5×、7×、10×、15×等符號可以區(qū)別。數(shù)字越大，放大率越高，使用時可根據(jù)需要。

（2）物鏡：因為它靠近被觀察的物體（標(biāo)本），因此也叫接物鏡。許多使用者在口語上把物鏡和目鏡都通俗地叫做鏡頭。物鏡安裝在鏡筒的下端，它的作用是將標(biāo)本第一次放大，然后再由目鏡將第一次放大的象做第二次放大。物鏡是決定顯微鏡性能的最重要部位，一般有2~4個，放大率也各不相同。鏡的圓筒上面有放大率如4×或10×（低倍鏡）、45×（高倍境）、100×（油鏡）等符號。有些顯微鏡的物鏡上還刻有鏡口率，如0.3、0.5、1.25等符號，這些符號的數(shù)字越大，放大率越高。

一般計算顯微鏡的放大倍數(shù)是：目鏡的放大率×物鏡的放大率＝顯微鏡的放大倍數(shù)。例如，目鏡的放大率為10，物鏡的放大率為45，這時顯微鏡的放大倍數(shù)為450。

（3）聚光器：是由一片或數(shù)片透鏡組成。其作用相當(dāng)于凸透鏡，起聚光線作用。裝在鏡臺下面，這樣就能增強標(biāo)本的照明，同時能使光線射入整個物鏡鏡口角。為了充分發(fā)揮顯微鏡的性能，在使用時聚光鏡和物鏡兩者的數(shù)值孔徑應(yīng)相一致。在使用高倍境時，必須配以聚光鏡，并且要求聚光鏡和物鏡口率一致，效果最好。聚光鏡的鏡口率可用光圈來調(diào)節(jié)，有些顯微鏡的光圈上刻有口徑的記號。使用某種高倍境時，只有對準(zhǔn)相應(yīng)刻度即可。

（4）光圈：也叫可變光圈，位于聚光鏡下方，由十幾張金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。推動光圈的把手，可以隨意調(diào)節(jié)圓孔的大小，有的光圈的邊框上還刻有標(biāo)明圓孔直徑的尺寸。（5）反光鏡：反光鏡通常一面是平面鏡，另一面是凹面鏡，裝在聚光鏡下面的鏡座上，可以水平與垂直兩個方向任意旋轉(zhuǎn)。反光鏡的作用是使光源發(fā)出的光線或天然光射向聚光器。在自然光線下，常用平面鏡；在室內(nèi)日光燈下，常用凹面鏡。

革蘭氏染色第一步：制片

在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑為1厘米的薄層。若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。第二步：自然干燥第三步：固定手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次，共約2-3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺得過燙為宜（不超過60℃），放置待冷后，進(jìn)行染色。第四步：染色1.初染（結(jié)晶紫）2-3滴一分鐘然后水洗。2.媒染（碘液）2-3滴一分鐘然后水洗。3.脫色（95%酒精）2-3滴一分鐘然后水洗。4.復(fù)染（沙黃復(fù)染液）2-3滴一分鐘然后水洗。第五步：干燥第六步：鏡檢

革蘭氏陽性菌被染成紫色，革蘭氏陰性菌被染成紅色。練習(xí)題1、高壓蒸汽滅菌時，當(dāng)壓力達(dá)15磅，溫度121℃時，維持時間()。A、10分鐘B、20分鐘C、30分鐘D、25分鐘2、在革蘭氏染色時草酸銨結(jié)晶紫滴加在已固定的涂片上染色，一般染()，用水洗去。A、半分鐘B、1分鐘C、1.5分鐘D、2分鐘3、鞭毛是細(xì)菌的()器官。A、捕食B、呼吸C、性D、運動4、真菌繁殖的主要特征是（）。A、隔壁B、孢子C、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)D、營養(yǎng)類型5、球菌在一個平面上連續(xù)分裂后，連成三個或三個以上的或長或短的鏈狀，這種細(xì)菌稱（）A、葡萄球菌B、雙球菌C、鏈球菌D、四聯(lián)球菌6、細(xì)菌的君體繁殖過程可分為四期，其中細(xì)菌體積增大，代謝活躍，但細(xì)胞分裂緩慢，此階段稱（）。

A、遲緩期B、對數(shù)生長期C、穩(wěn)定期D、哀退期7、固體培養(yǎng)基理想的凝固劑是（）。

A、瓊脂B、明膠C、血清D、海藻酸鈉8、殺死物體中病原微生物的方法，叫（）。

A、消毒B、無菌C、防腐D、抑菌9、對微生物影響的物理因素包括（）。A、溫度、干燥B、干燥、滲透壓C、溫度、輻射D、B+C

10、VP試驗陽性，呈（）色。

A、紅B、綠C、黃D、褐11、革蘭氏染色液的第一液是（）。A、碘液B、結(jié)晶紫C、95％乙醇D、石碳酸復(fù)紅12、載玻片和蓋玻片在清洗前可先在（）溶洗中浸泡1h。

A、2％的鹽酸B、8％鹽酸C、2％的NaOHD、6％NaOH13．飲料作沙門氏菌檢驗時，需前增菌時間是()。

(A)4h(B)6h(C)12—16h(D)18—24h14、采用高壓蒸汽滅菌時，一般選用（）。

A、121℃20minB、100℃30minC、115℃15minD、110℃20min15、冰棒檢驗取樣前，操作人員應(yīng)（）A、用95％的酒精棉球擦手

B、用75％的酒精棉球擦手和容器口周圈C、用65％的酒精棉球擦容器口周圍D、用酒精燈烤容器口周圍16、溶血性鏈球菌在血清肉湯中生長時，管中的現(xiàn)象是()。A、塊狀沉淀B、絮狀或顆粒狀沉淀C、均勻生長D、混濁17、尿素酶試驗陽性呈()色。A、黑B、紅C、綠D、蘭18、S.S瓊脂，屬()培養(yǎng)基。 A、營養(yǎng)B、鑒別C、選擇D、基礎(chǔ)19．革蘭氏染色陽性細(xì)菌，在顯微鏡下呈()色(A)紅(B)紫(C)黃(D)綠20、在微生物檢測中最常見的是細(xì)胞生物，其中最多的是（）。A、病毒 B、真菌 C、霉菌 D、細(xì)菌21、各種桿菌的長短、大小和粗細(xì)很不一致，桿菌一般長約()微米。A、0．7～1．5B、2～3C、3～5D、6~1022．糞大腸菌群檢驗是將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于()培養(yǎng)基。(A)乳糖發(fā)酵管(B)葡萄糖發(fā)酵管

(C)EC肉湯管(D)蛋白胨水管23、半固體接種，采用下列哪種方法()。A、涂布B、穿刺C、點種D、劃線24．原核細(xì)胞型微生物只有()，無核膜。

A、原始核B、核蛋白C、核仁：D、細(xì)胞漿25．菌落計數(shù)時，固體樣品加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以()的速度—處理1分鐘。(A)4.000－6.000rpm(B)6.000－8.000rpm

(C)8.000-10.000rpm(D)10.000—12.00026．細(xì)菌群體生長繁殖過程，