微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

專(zhuān)題2微生物的培育與運(yùn)用了解有關(guān)微生物及培育基的根底知識(shí)，進(jìn)展無(wú)菌技術(shù)的操作，進(jìn)展微生物的培育。一、課標(biāo)題的：掌握培育基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線(xiàn)法等根本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)展無(wú)菌操作，勝利地培育微生物。無(wú)菌技術(shù)的操作。二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：三、技藝目的：微生物包括哪五類(lèi)：病毒細(xì)菌放線(xiàn)菌真菌原生動(dòng)物特點(diǎn)：構(gòu)造簡(jiǎn)單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才干看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞構(gòu)造.且體內(nèi)普通不含有葉綠素.不能進(jìn)展光協(xié)作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、根底知識(shí)：

(一)微生物細(xì)菌的外形與大小細(xì)菌：?jiǎn)渭?xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡察看圖1-1常見(jiàn)的三種細(xì)菌典型形狀A(yù).球菌B.桿菌C.弧菌細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌〔纖〕毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中又有液泡、儲(chǔ)存性顆粒、核質(zhì)等。細(xì)菌的構(gòu)造圖1-3細(xì)菌的構(gòu)造*細(xì)胞壁構(gòu)造特點(diǎn)：堅(jiān)韌且有彈性細(xì)胞壁有哪些功能？①固定細(xì)胞外形；②維護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷；③阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞；④使細(xì)胞具有致病性及對(duì)噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面構(gòu)成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜〔如溫度、水分適宜〕的時(shí)候，芽孢又可以萌生，構(gòu)成一個(gè)細(xì)菌.菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培育基上大量繁衍時(shí)，就會(huì)構(gòu)成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形狀構(gòu)造的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要根據(jù)。菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型。自養(yǎng)菌:分類(lèi),舉例?異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌放線(xiàn)菌1、構(gòu)造：?jiǎn)渭?xì)胞原核分支狀的菌絲〔基內(nèi)菌絲、氣生菌絲〕鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線(xiàn)菌產(chǎn)生的運(yùn)用:病毒的構(gòu)造2、病毒的增殖：真菌一、根底知識(shí)：〔二〕培育基培育基〔培育液〕是由人工方法配制而成的，專(zhuān)供微生物生長(zhǎng)繁衍運(yùn)用的混合營(yíng)養(yǎng)液?！?〕按物理形狀分：固體培育基和液體培育基、半固體培育基。其中固體培育基用于菌種保管及分別、鑒定菌落、活菌計(jì)數(shù)等，半固體培育基可察看微生物的運(yùn)動(dòng)，液體培育基常用于發(fā)酵工業(yè)?！?〕按功能分：選擇培育基和鑒別培育基。〔3〕按成分分：天然培育基和合成培育基。1.培育基的類(lèi)型和用途選擇培育基參與青霉素的培育基:分別酵母菌、霉菌等真菌參與高濃度食鹽的培育基:分別金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培育基:分別固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培育基:分別自養(yǎng)型微生物參與青霉素等抗生素的培育基:分別導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞參與氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培育基:分別雜交瘤細(xì)胞天然培育基有血清、血漿、和組織提取液〔如雞胚和牛胚浸液〕。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培育效果好缺陷：來(lái)源受限;成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培育基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：規(guī)范化消費(fèi)，組分和含量相對(duì)固定;本錢(qián)低缺陷：短少某些成分，不能完全滿(mǎn)足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需求。合成培育基:天然培育基：血清中含有：①多種蛋白質(zhì)〔白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等〕②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分人工合成培育基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁衍，還需補(bǔ)充一定量的天然培育基〔如血清〕。液體培育基：外表生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)固體培育基：菌落，菌苔半固體培育基：無(wú)動(dòng)力有動(dòng)力(彌散)(能否運(yùn)動(dòng))2.不同的微生物往往需求采用不同的培育基配方(參考教材附錄內(nèi)容)3.不論哪種培育基，普通都含有水、碳源、和氮源、無(wú)機(jī)鹽、等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還需求滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而本身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、浸透壓等的要求。4.培育基的用途液體培育基：增菌固體培育基：純化，增菌半固體培育基：動(dòng)力檢測(cè)，保種二、無(wú)菌技術(shù)1.無(wú)菌技術(shù)的概念無(wú)菌操作泛指在培育微生物的操作中，一切防止雜菌污染的方法。無(wú)論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線(xiàn)操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需求做到“無(wú)菌〞，即防止雜菌污染。只需熟練、規(guī)范地進(jìn)展無(wú)菌操作，才能夠勝利地培育微生物。〔１〕消毒定義：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過(guò)程。區(qū)分為高程度消毒〔High-levelDisinfection〕、中程度消毒〔Intermediate-levelDisinfection〕、低程度消毒〔Low-levelDisinfection〕三種方式。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別〔2〕滅菌的定義：以化學(xué)劑或物理方法消滅一切微生物，包括一切細(xì)菌的繁衍體、芽孢、霉菌及病毒，而到達(dá)完全無(wú)菌之過(guò)程。

滅菌消毒技術(shù)是微生物有關(guān)任務(wù)中最普通也是最重要的技術(shù)。1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)展皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線(xiàn)消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅一切的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以根本堅(jiān)持培育基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。

有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣經(jīng)過(guò)，而空氣中的其他微生物不能經(jīng)過(guò)。

而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專(zhuān)為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。分類(lèi)定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學(xué)法：醛類(lèi)、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線(xiàn)、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)低效消毒法殺滅細(xì)菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類(lèi)、中草藥、金屬離子無(wú)菌技術(shù)3.微生物實(shí)驗(yàn)室培育的根本操作程序1、器具的滅菌2、培育基的配制3、培育基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培育7、菌種的保管1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培育物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？2.請(qǐng)他判別以下資料或器具能否需求消毒或滅菌。假設(shè)需求，請(qǐng)選擇適宜的方法。〔1〕培育細(xì)菌用的培育基與培育皿〔2〕玻棒、試管、燒瓶和吸管〔3〕實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無(wú)菌技術(shù)還能有效防止操作者本身被微生物感染。答：〔1〕、〔2〕需求滅菌；〔3〕需求消毒。三、實(shí)驗(yàn)操作1.制備牛肉膏蛋白胨培育基〔用于培育細(xì)菌〕1．計(jì)算、稱(chēng)量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．64．過(guò)濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過(guò)程中留意不要使培育基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超越三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟8．滅菌:將50ml培育基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培育基用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:待培育基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。〔倒平板操作見(jiàn)課本〕2d后察看平板，無(wú)雜菌污染才可用來(lái)接種.10．無(wú)菌檢查：將滅菌的培育基放入37℃的溫室中培育24—48小時(shí)，以檢查滅菌能否徹底。倒平板技術(shù)1.培育基滅菌后，需求冷卻到50℃左右時(shí)，才干用來(lái)倒平板。他用什么方法來(lái)估計(jì)培育基的溫度？問(wèn)題討論答：可以用手觸摸盛有培育基的錐形瓶，覺(jué)得錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)展倒平板了。2.為什么需求使錐形瓶的瓶口經(jīng)過(guò)火焰？答：經(jīng)過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培育基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過(guò)程中，假設(shè)不小心將培育基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培育微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培育基外表的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培育基外表的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培育基，呵斥污染。答：空氣中的微生物能夠在皿蓋與皿底之間的培育基上繁殖，因此最好不要用這個(gè)平板培育微生物。2、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線(xiàn)法和稀釋涂布平板法平板劃線(xiàn)法:經(jīng)過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培育基外表延續(xù)畫(huà)線(xiàn)的操作,將聚集的菌鐘逐漸稀釋分散到培育基的外表.在數(shù)次畫(huà)線(xiàn)后,可以分別到由一個(gè)細(xì)胞繁衍而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)平板劃線(xiàn)的操作方法交叉劃線(xiàn)法延續(xù)劃線(xiàn)法平板劃線(xiàn)時(shí)不能劃破培育基的緣由一旦劃破，會(huì)呵斥劃線(xiàn)不均勻，難以到達(dá)分別單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法構(gòu)成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)構(gòu)成一個(gè)條狀的菌落。問(wèn)題討論1.為什么在操作的第一步以及每次劃線(xiàn)之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線(xiàn)操作終了時(shí)，依然需求灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了防止接種環(huán)上能夠存在的微生物污染培育物；每次劃線(xiàn)前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線(xiàn)終了后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線(xiàn)時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線(xiàn)的末端，從而經(jīng)過(guò)劃線(xiàn)次數(shù)的添加，使每次劃線(xiàn)時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線(xiàn)終了后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，防止細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)展劃線(xiàn)？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線(xiàn)操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線(xiàn)的末端開(kāi)場(chǎng)劃線(xiàn)？答：劃線(xiàn)后，線(xiàn)條末端細(xì)菌的數(shù)目比線(xiàn)條起始處要少，每次從上一次劃線(xiàn)的末端開(kāi)場(chǎng)，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線(xiàn)次數(shù)的添加而逐漸減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁衍而來(lái)的菌落。問(wèn)題討論涂布平板的一切操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)展。結(jié)合平板劃線(xiàn)與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)展無(wú)菌操作？應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌〞。例如，酒精燈與培育皿的間隔要適宜、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周?chē)鹊?。微生物的恒溫培育微生物的恒溫培育菌種的保管1、暫時(shí)保藏：接種到固體斜面培育基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保管。2、長(zhǎng)期保管：甘油冷凍管藏法四、課題成果評(píng)價(jià)〔一〕培育基的制造能否合格假設(shè)未接種的培育基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，闡明培育基的制備是勝利的，否那么需求重新制備?！捕辰臃N操作能否符合無(wú)菌要求假設(shè)培育基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、外形、大小根本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，那么闡明接種操作是符合要求的；假設(shè)培育基上出現(xiàn)了其他菌落，那么闡明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未到達(dá)要求，需求分析緣由，再次練習(xí)?！踩衬芊襁M(jìn)展了及時(shí)細(xì)致的察看與記錄培育12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)察看記錄的同窗會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能察看到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培育學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。本課題知識(shí)小結(jié):【典例解析】例1．關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表達(dá)中，正確的A.是碳源的物質(zhì)不能夠同時(shí)是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的詳細(xì)情況分析。對(duì)于A(yíng)、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完好的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無(wú)機(jī)物種類(lèi)繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無(wú)機(jī)鹽；而NaCl那么只能提供無(wú)機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無(wú)機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的了解不正確的選項(xiàng)是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培育基和發(fā)酵設(shè)備都必需滅菌D.滅菌必需在接種前答案：B解析：滅菌是微生物發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)