動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)十五動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞檢測(cè)和細(xì)胞表達(dá)等成套技術(shù)的原理和方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容培養(yǎng)基配制、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇等基本技術(shù)；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、細(xì)胞活性檢測(cè)等常用技術(shù)；細(xì)胞污染檢測(cè)方法與技術(shù)；病毒在細(xì)胞中的感染與增殖、重組病毒異源蛋白的細(xì)胞表達(dá)等實(shí)用技術(shù)。實(shí)驗(yàn)用品材料：Sf細(xì)胞、Hi5細(xì)胞等器材：CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、培養(yǎng)基抽濾裝置、電泳儀、離心機(jī)、pH計(jì)、液氮罐（含液氮）、水浴鍋、溫度計(jì)、培養(yǎng)瓶、血清瓶、5ml和10ml移液管、不銹鋼移液管筒、大小不銹鋼飯盒、酒精燈、吸耳球、血球計(jì)數(shù)板、96孔板、24孔板、無(wú)菌凍存管、離心管、記號(hào)筆、一次性過(guò)濾器、微量加樣器、精密pH試紙、酒精棉球等試劑與藥品：Grace培養(yǎng)基、胎牛血清、甘油、DMSO、雙抗（青霉素、鏈霉素）100u/ml、Hank’s液、胰蛋白酶、臺(tái)盼藍(lán)、液氮、分析純無(wú)水酒精、95%醫(yī)用酒精、Tris堿、硼酸、EDTA、瓊脂糖粉（電泳用）dNTPs、Taq酶、支原體檢測(cè)試劑盒、DNA提取試劑盒DNeasyBlood&Tissuekit（Qiagen）等。實(shí)驗(yàn)方法與步驟（一）培養(yǎng)基配制、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇緩沖液及培養(yǎng)基配制Hank’s液：KH2PO40.06g,NaCl8.0g,NaHCO30.35g,KCl0.4g，葡萄糖1.0g,Na2HPO4?H2O0.06g,加H2O至1000ml，高壓滅菌。4°C下保存。胰蛋白酶液：2 2稱取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無(wú)Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，濾器過(guò)濾除菌，4C保存，用前可在37C下回溫。4%臺(tái)盼藍(lán)染液：稱取臺(tái)盼藍(lán)4克，加雙蒸水至100ml。MTT溶液：MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液或無(wú)酚紅的Hank’s液中。4C下保存。Grace培養(yǎng)基：取一份GIBCO公司的Grace培養(yǎng)基粉劑，按說(shuō)明用量加入1000ml三蒸水100單位/毫升青、鏈霉素，充分混勻使溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.8左右。0.22Mm濾膜抽濾除菌，4C下保存。此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。使用前加入10%胎牛血清。細(xì)胞凍存液：基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入10%DSMO,20%胎牛血清，用前配制。PBS緩沖液：137mmol/LNaCl,2.7mmol/LKCl,8.1mmol/LNHPO,1.5mmol/LKHPO,2 4 2 4pH7.0,121°C(15磅)消毒20min。弱硫酸洗液：重鉻酸鉀10g，粗濃硫酸200ml，水100ml。先稱取粗制重鉻酸鉀10g,放于大燒杯內(nèi)，加普通水100ml使重鉻酸鉀溶解(必要時(shí)可加熱溶解)。再將粗制濃硫酸(200ml)緩緩沿邊緣加入上述重鉻酸鉀溶液中即成。加濃硫酸時(shí)須用玻璃棒不斷攪拌，并注意防止液體外溢。若用瓷桶大量配制，注意瓷桶內(nèi)面必須沒(méi)有掉瓷，以免強(qiáng)酸燒壞瓷桶。配時(shí)切記，不能把水加于硫酸內(nèi)(將因硫酸遇水瞬間產(chǎn)生大量的熱量使水沸騰，體積膨脹而發(fā)生爆濺)。培養(yǎng)瓶等玻璃制品的清洗與消毒細(xì)胞培養(yǎng)用玻璃制品的清洗包括洗衣粉液浸泡、刷洗、自來(lái)水沖洗及酸泡等步驟。酸泡24小時(shí)后，用流水沖洗將酸液完全清洗掉，然后用蒸溜水浸泡和沖洗數(shù)次，烘干備用。注意接觸洗液時(shí)必須戴防酸手套以防護(hù)。將培養(yǎng)瓶或移液管等分別放入消毒盒或筒中，121C(15磅)消毒30min，烘干后備用。細(xì)胞培養(yǎng)與傳代(以昆蟲(chóng)細(xì)胞Tn-Hi5為例)在培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)成單層，鋪滿瓶底時(shí)就需要傳代了。傳代步驟如下：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。用0.1%新潔爾滅溶液或70%酒精擦凈超凈臺(tái)臺(tái)面。打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面20min左右，關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈，打開(kāi)抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。操作前用肥皂洗手，用70%酒精擦拭消毒雙手。點(diǎn)燃酒精燈；將培養(yǎng)瓶瓶口用70%酒精消毒，過(guò)酒精燈火焰后放置于酒精燈旁。在火焰周圍打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶蓋，用無(wú)菌移液管按比例吸取5~10mLGrace完全培養(yǎng)基，小心吸打幾次，以將瓶底的細(xì)胞吹起混勻，再將細(xì)胞懸液均勻分裝到新的培養(yǎng)瓶中。對(duì)于貼壁很緊的細(xì)胞，先倒掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，再向培養(yǎng)瓶中加入1mL胰酶，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(3?5mL/小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。將傳代細(xì)胞放到培養(yǎng)箱中，28C培養(yǎng)。每隔24hr在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞又長(zhǎng)成單層時(shí)再次進(jìn)行傳代。細(xì)胞凍存預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10%DMSO。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入適量?jī)龃嬉?，用吸管吹打制成?xì)胞懸液(1X106?1X107細(xì)胞/ml)。在安倍瓶或凍存管中加1?1.5ml細(xì)胞懸液，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。將封好的安倍瓶或凍存管置于塑料盒或小袋，以1°C/min速率進(jìn)行冷凍，在30?40min內(nèi)使其到達(dá)液氮表面，再停30分鐘后，將其投入液氮中，-70C凍存可達(dá)數(shù)年。細(xì)胞復(fù)蘇檢查凍存記錄，確定將要復(fù)蘇的凍存管的位置。將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37C水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染，不定時(shí)攪拌加速解凍。當(dāng)細(xì)胞完全解凍后，用70%乙醇擦拭冷凍管進(jìn)行消毒，然后在超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)凍存管。用1ml移液管將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)基緩慢加到細(xì)胞懸液中以稀釋細(xì)胞和保護(hù)劑。將細(xì)胞置于28C培養(yǎng)。注意在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，必要時(shí)更換培養(yǎng)基，添加新鮮培養(yǎng)基，直至細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)。注意：細(xì)胞凍存與復(fù)蘇時(shí)需要接觸液氮罐中的液氮，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴防護(hù)面罩或眼鏡以及手套，以免造成機(jī)體損傷。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定與細(xì)胞活性檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定(MTT法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為5X103、1X104、2X104、3X104、4X104、5X104等6種濃度分別接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度接種6孔，共同時(shí)接種7板。28C培養(yǎng)。接種24、48、72、96、120、144、168hr后，各取一個(gè)96孔板，在每孔加入MTT溶液20pL，繼續(xù)孵育4hr后終止培養(yǎng)，快速翻轉(zhuǎn)96孔板，倒掉培養(yǎng)液，每孔加入150pLDMSO，震蕩10min使藍(lán)紫色甲^完全溶解，用酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)490nm處吸光值，并以只加培養(yǎng)基而未加細(xì)胞的孔為對(duì)照調(diào)零。每個(gè)濃度取6孔OD值的平均數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞活性檢測(cè)(臺(tái)盼藍(lán)法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液。在900uL細(xì)胞懸液中加入100uL4%的臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻染色5min后，制片觀察。在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞拒染呈無(wú)色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。隨機(jī)計(jì)數(shù)視野內(nèi)死活細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞的存活率。細(xì)胞污染檢測(cè)方法與技術(shù)常見(jiàn)細(xì)胞污染類型的初步鑒定細(xì)菌污染：短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)基顏色變黃，明顯渾濁，在低倍鏡下即可見(jiàn)細(xì)胞之間空隙處有顆粒物。真菌污染：短時(shí)間內(nèi)不易察覺(jué)，培養(yǎng)基尚澄清。久之可用肉眼觀察到培養(yǎng)基中有菌絲或菌落出現(xiàn)。用倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)絲狀或樹(shù)枝狀菌絲。支原體污染：周期長(zhǎng)，用常規(guī)方法不易檢測(cè)，但影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與活性。如果出現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間不明原因的生長(zhǎng)不良和活性改變，則需進(jìn)行支原體檢測(cè)。細(xì)胞支原體污染的PCR檢測(cè)DNA提?。盒枰獧z測(cè)支原體污染的細(xì)胞系在檢測(cè)前兩周內(nèi)用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以保證支原體在培養(yǎng)基上清中的效價(jià)在PCR測(cè)定范圍之內(nèi)。收集1mL培養(yǎng)上清液，含活的或死的細(xì)胞，13000g離心5min，沉淀用1mLPBS重懸浮，渦旋混勻。再次離心洗滌細(xì)胞，用1mLPBS重懸浮，渦旋混勻。重離心后，沉淀用100uLPBS重懸，渦旋混勻，然后加熱至90。。，15min。細(xì)胞分解后，用Qiagen公司的DNA提取試劑盒DNeasyBlood&Tissuekit提取DNA，-21r貯存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)：根據(jù)支原體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物的EB檢測(cè)。病毒在細(xì)胞中的感染增殖與重組病毒異源蛋白的細(xì)胞表達(dá)1.病毒在細(xì)胞中的感染增殖與TCID50的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整到2~3X105個(gè)/ml，接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100M。在24孔微量培養(yǎng)板中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-2到10-1。。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔細(xì)胞，每孔接種100M。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排(100M生長(zhǎng)液+100M細(xì)胞懸液)。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。按Reed-Muench法計(jì)算TCID50：Reed-Iuenchp^氏法病毒液稀釋度出現(xiàn)CFE孔數(shù)無(wú)CPE孔數(shù)累計(jì)出現(xiàn)CPE孔所占的％CPE孔數(shù)無(wú)CFE孔數(shù)10-180; 27 :0忡80190100.^19/19)10"371!11：1^91.61"35'46 '40(4/10)10-5171130.7(1/14)'10"60：.8.0-21oC0Z2OCPE：Cytopath.iceffect距離比例=(高于即%病變率的百分?jǐn)?shù)-災(zāi)諺/［高于5醐病變率的百分?jǐn)?shù)-低于5福病變率的百分?jǐn)?shù))=笠91.所戒懇1.阮破=0.8lgTCID50=距離比例多稀釋度對(duì)數(shù)