具核梭桿菌通過上調c

具核梭桿菌通過上調c-Jun表達促進結直腸癌細胞系caco-2

的DNA復制曾利紅;林欣;何杰;黃惠康;杜艷蕾;趙沖;魏芳;王紅【摘要】目的研究具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)促進結直腸癌(colorectalcancer,CRC)細胞系caco-2DNA復制，并初步探討其機制.方法Fn感染caco-2細胞后，通過EdU檢測caco-2細胞DNA復制情況，采用RT-PCR及Westernblotting檢測c-Jun基因轉錄和蛋白表達,Westernblotting檢測細胞增殖相關基因CCND1的表達，利用siRNA敲低c-Jun表達Westernblotting技術檢測感染Fn后caco-2細胞CCND1蛋白表達及EdU檢測caco-2DNA復制情況.結果Fn感染caco-2細胞6h后,caco-2細胞DNA復制顯著增加,c-Jun和CyclinD1表達量增加,Fn感染并敲低c-Jun后,caco-2細胞DNA復制減少,CyclinD1蛋白表達量也顯著降低.結論Fn可通過上調c-Jun的表達促進CRC細胞系caco-2的DNA復制.％ObjectiveToinvestigatetheDNA-replicationinducedbyFusobacteriumnucleatum(Fn)inhumancolorectalcancer(CRC)celllinecaco-2cells,inordertomakeapreliminarydiscussiononthemechanism.MethodsTheDNA-replicationwasdetectedbyEdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)andtheexpressionofc-JunwasdetectedbyRT-PCRandWesternblottingaftercaco-2cellsinfectedwithFn.TheexpressionofCCND1wasdetectedbyWesternblottingaftercaco-2cellsinfectedwithFn.c-JunwasknockeddownbyspecificsiRNAtransfectioncells,whilethesecellswereinfectedbyFn,theDNA-replicationwasdetectedbyEdUaswellsastheexpressionofCCND1wasdetectedbyWesternblotting.ResultsAfter6hoursinfectedbyFn,DNA-replicationdetectedbyEdUwassignificantlyincreasedincaco-2cells.Thelevelsofc-JunandCyclinD1weresignificantlyincreasedincaco-2cellsduringFninfection.Furthermore,WhenFnwasinfectedandc-Junwasknockeddown,theDNA-replicationwasdecreasedincaco-2cellsandtheexpressionofCyclinD1proteinwassignificantlydecreased.ConclusionFncanstimulatetheDNA-replikationofcaco-2cellsviaincreasingtheexpressionofc-Jun.【期刊名稱】《胃腸病學和肝病學雜志》【年(卷)，期】2017(026)008【總頁數】5頁(P852-856)【關鍵詞】具核梭桿菌;結直腸癌;c-Jun;caco-2【作者】曾利紅;林欣;何杰;黃惠康;杜艷蕾;趙沖;魏芳;王紅【作者單位】廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180;廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180;廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180;廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180;廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180;廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180;廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180;廣州醫(yī)科大學附屬市一人民醫(yī)院消化內科廣東廣州510180【正文語種】中文【中圖分類】R735.3結直腸癌(colorectalcancer,CRC)是一種常見的消化道腫瘤，其發(fā)生是一個多階段、多步驟的病理過程，與多個癌基因激活和抑癌基因失活有關。近年來研究［1］發(fā)現，腸道菌群也可能通過腸道黏膜屏障受損、慢性炎癥反應、細菌酶、毒性代謝產物作用等多種機制促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。其中具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)被認為與CRC的發(fā)生、發(fā)展高度相關。Fn屬梭桿菌屬，是革蘭陰性無芽孢桿菌，專性厭氧，不具有運動能力。研究發(fā)現，Fn可通過代謝產物(丁酸、硫化氫)等破壞腸上皮DNA完整性，其中硫化氫可為CRC細胞的能量代謝來源，促進其增殖，Fn還可通過結構蛋白與宿主細胞相識別，啟動炎癥相關下游信號通路，促進IL-6、IL-8、IL-18的釋放。c-Jun基因是禽肉瘤逆轉錄病毒基因ASV17的細胞內同源基因。研究［2］顯示，c-Jun基因在蛋白水平或基因的改變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。c-Jun與激活的ras基因一起可以轉化細胞，c-Jun蛋白是細胞增殖的正向調節(jié)物［3］。目前尚無研究證實，Fn感染CRC細胞后促進c-Jun基因的表達，并通過上調c-Jun基因的表達促進CRC細胞DNA復制。本研究擬針對Fn感染CRC細胞株系caco-2細胞，探討用共培養(yǎng)的方法讓Fn感染CRC細胞系caco-2細胞后上調c-Jun基因的表達對caco-2細胞DNA復制是否有調節(jié)作用及該調節(jié)作用與哪些基因的激活與抑制相關，為Fn致癌機制提供實驗依據。1.1主要實驗材料與儀器RIPA裂解液、Cooktail、蛋白濃度測定試劑盒、Lipo3000等均購自美國ThermoFisherScientific公司，鼠抗人［3-actin單克隆抗體、兔抗人CyclinD1單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠抗體等均購自美國ABCAM生物有限公司，兔抗人c-Jun多克隆抗體購自美國CST公司，PVDF膜、ECL發(fā)光液均購自美國Millipore公司，針對c-Jun特異性小干擾RNA及陰性對照小干擾RNA、EdU試劑盒均購自銳博生物有限公司，opti-MEM、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶等均購自美國Life公司，胎牛血清、腦心浸液肉湯、哥倫比亞血平板培養(yǎng)基、caco-2細胞購自美國ATCC細胞庫，CO2細胞培養(yǎng)箱（H90中國力康公司）、共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、NaNoDROP（美國ThermoFisherScientific公司）、BIO-RAD電泳儀（美國BIO-RAD公司）、化學發(fā)光分子成像系統(tǒng)（TANON公司）、熒光定量梯度PCR儀（qTower2.0德國耶拿公司）。1.2實驗方法1.2.1細菌培養(yǎng):Fn菌株ATCC10953（購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心'）接種于哥倫比亞血平板培養(yǎng)基，37°C厭氧培養(yǎng)48h，生化鑒定、傳代。液體培養(yǎng)20h后4000r/min,Rt離心10min，收集細菌，PBS洗滌3次，重懸于PBS溶液中，NaNoDROP測量600nm的吸光度值，將菌懸液調制1x108CFU/ml備用。1.2.2細胞培養(yǎng):人結腸癌細胞株caco-2購自美國ATCC公司，經復蘇后，用含200g/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。將caco-2細胞鋪于細胞6孔培養(yǎng)板，細胞貼壁融合度達到70%時，更換新鮮無雙抗培養(yǎng)基，加入Fn，分別共培養(yǎng)6h、12h，收集樣品檢測。實驗設對照組與感染組，未加細菌組為對照組（Blank）,加細菌處理組為感染組（Fn+）,MOI=1:200。1.2.3轉染:siRNA轉染實驗參照LIPO3000試劑說明書進行操作。轉染前1d將1.5x105個細胞/孔接種于6孑L培養(yǎng)板，一共設置3組，分為空白對照組（Blank）、陰性對照組（NCcontrol）、sic-Jun組。EdU:將24mmx24mm蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，每孔約1x105個細胞，待細胞融合至70%時，更換新鮮培養(yǎng)基，按MOI=200:1加入Fn共培養(yǎng)6h,PBS清洗3次后，按EdU試劑盒說明書按步驟加入試劑，染色、固定、封片，避光保存，由廣州市第一人民醫(yī)院中心實驗室共聚焦顯微鏡室進行熒光拍攝。RT-PCR檢測Fn:感染Caco-2細胞6h、12h后，分別以Trizol提取總RNA。PrimeScriptRTReagentKit逆轉錄cDNA，實時PCR擴增。各引物序列見表1。每組實驗重復3次。1.2.6Westernblotting檢測Fn:感染Caco-2細胞6h、12h后，提取總蛋白，測定蛋白質量濃度。取20pl蛋白樣品進行SDS,80V恒壓模式電泳20min后轉110V恒壓電泳，350mA電流轉膜70min,5%脫脂奶粉封閉1h,加入一抗后4C孵育過夜。TBST清洗3遍，與相應的二抗室溫孵育1h,TBST清洗3遍，加入化學發(fā)光液室溫作用1min，化學發(fā)光分子成像儀曝光。每組實驗重復3次。1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料用±s表示。兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。Fn感染促進caco-2細胞DNA復制Fn與caco-2細胞共培養(yǎng)12h（MOI=200），建立Fn與caco-2的感染模型，EdU檢測DNA復制情況，與對照組相比，細胞復制顯著活躍（見圖1A、1B,P<0.01）。Westernblotting檢測G1/S期檢驗點關鍵蛋白CyclinD1的表達情況，與對照組相比，感染6h后，CyclinD1表達量差異無統(tǒng)計學意義（見圖1C、1E,P>0.05），感染12h后，CyclinD1表達量明顯升高（見圖1D、1E,P>0.05）。Fn感染促進caco-2細胞c-Jun、炎癥因子IL-8表達上調Fn與caco-2細胞共培養(yǎng)6h（MOI=200），進行RNA-sequencing檢測c-Jun、IL-8mRNA表達，與對照組相比，c-Jun、IL-8mRNA表達顯著增加（見圖2A,P<0.01;見圖2B,P<0.001）。RT-PCR進一步驗證c-Jun、炎癥因子IL-8mRNA表達情況，c-Jun、IL-8轉錄水平表達顯著上調（見圖2C~2F,P<0.01）。Westernblotting進一步驗證c-Jun蛋白水平表達，與對照組相比，c-Jun蛋白表達量顯著升高（見圖2G~2I,P<0.05）。Fn通過上調c-Jun表達促進細胞DNA復制在caco-2細胞轉染c-JunsiRNA12h后，加入Fn共培養(yǎng)12h,EdU檢測DNA復制情況，與對照組相比，細胞復制顯著活躍(見圖3A、3B，P<0.01)。Fn共培養(yǎng)12h,Westernblotting檢測CyclinD1蛋白水平表達情況，與對照組相比，CyclinD1蛋白表達量顯著下降(見圖3C、3D,P<0.01)。在CRC的發(fā)生、發(fā)展中，腫瘤微環(huán)境的作用是一個重要因素，腫瘤細胞周圍的間質細胞、免疫細胞及各種細胞所分泌的細胞因子、免疫因子等構成了腫瘤細胞相互作用的內環(huán)境，成為腫瘤微環(huán)境(tumorenviroment,TME)。腫瘤微環(huán)境中，慢性炎癥是促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個關鍵環(huán)節(jié)。炎性微環(huán)境中存在的活性氮和活性氧物質導致細胞的DNA發(fā)生基因突變，誘發(fā)了細胞的惡性轉變，炎性環(huán)境過度激活促增殖通路和抑制凋亡的通路，而持續(xù)的炎癥狀態(tài)又為細胞的惡性增殖、血管新生、癌細胞的遷移和侵襲提供了必要的環(huán)境，進一步加速了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程［4］。在胃腸道癌癥的發(fā)生、發(fā)展中，慢性炎癥往往與微生物的感染有關。在多項研究中均發(fā)現腸道菌群紊亂與CRC有關，腸道菌群通過其結構蛋白、細菌酶、毒性代謝產物促進腸黏膜局部慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展，同時，研究人員證實，小鼠腸道微生物組不僅影響了局部炎癥，還影響了全身炎癥的形成［5］。腸道菌群中，Fn已被證實與炎癥性腸病、腸腺瘤、CRC等多種腸道疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關［6-7］。Fn可以通過脂蛋白Fad-I被宿主Toll樣受體-1/2(TLR-1/2)和Toll樣受體2/6(TLR-1/2)識別并上調防御素P2(p-defensin3)表達，而感染Fn的CRC細胞系，在裸鼠體內比未感染的細胞在裸鼠體內更快形成腫瘤，體積也更大［8］。Fn感染結腸細胞后能直接激活TLR4/MYD88/NF-KB信號通路［9］。綜合已有的研究，Fn侵襲宿主上皮后可促進炎癥和促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Fn侵襲入上皮細胞后促進炎癥相關因子TNF-a、IL-8、IL-1&等表達上調［4］。在我們的研究中也觀察到Fn感染caco-2細胞顯著上調IL-8轉錄水平的表達。Fn的感染能促進細胞增殖［10］,在我們的研究中，通過Westernblotting檢測CyclinD1表達和EdU發(fā)現，Fn感染caco-2細胞能夠顯著促進caco-2細胞DNA復制，DNA復制積累，進一步增加了DNA復制錯誤發(fā)生率和染色體損傷。在細胞中，細胞每分裂一次，即DNA復制每發(fā)生一次，堿基錯配的概率為1/1010-1/109,DNA錯配發(fā)生率增加，也可能造成DNA錯配修復異常。Tomasetti等［12］利用其數學模型將來自英國的32種癌癥病例患者進行分析，發(fā)現66%的癌癥驅動基因突變源于DNA復制錯誤，癌癥的發(fā)生、發(fā)展與DNA復制錯誤有關。Fn能通過其毒力因素如FadA、Fap2和梭菌屬夕卜膜蛋白FomA識別、侵襲入血管內皮和腸上皮細胞，激活多個信號通路，如B-catenin［10］、NF-kB［10］等，但目前，較少有研究顯示Fn感染引發(fā)結腸炎癥和致癌作用的下游事件。c-Jun是禽肉瘤逆轉錄病毒基因ASV17的細胞內同源基因，c-Jun蛋白水平或基因的改變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，c-Jun可能通過抑制WWOX的腫瘤抑制作用促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展［2］。在本研究中，Fn感染能夠促進caco-2細胞高表達c-Jun蛋白和CyclinD1,當caco-2細胞轉染c-jun特異性siRNA后，Fn感染不能引起CyclinD1高表達，因此，Fn感染引起的CyclinD1高表達與c-Jun高表達直接相關，而CyclinD1是DNA復制的標志性蛋白，也說明c-Jun高表達在促進DNA復制過程發(fā)揮著關鍵作用。c-Jun是p-catenin信號通路中的靶基因，能夠整合細胞內夕卜多種刺激調節(jié)下游靶基因的表達。Fn可利用獨特的FadA與宿主細胞內Ecadherin結合，抑制抑癌基因的抑制作用，激活p-catenin信號通路，上調相關轉錄因子［11］。因此，Fn感染引起的c-Jun蛋白高表達與促進DNA復制作用可能是通過P-catenin信號通路的激活來實現。目前，普遍認為癌癥是癌癥驅動基因發(fā)生突變后造成細胞異常增殖引起，而引起癌癥驅動基因發(fā)生突變的原因主要有遺傳、環(huán)境和DNA復制錯誤等［11］。本研究發(fā)現，Fn感染能夠引起DNA復制相關蛋白CyclinD1表達增加，促進DNA復制，Fn感染能夠上調c-Jun表達，Fn感染對DNA復制的調控可能是通過上調c-Jun表達介導的。綜上所述，Fn感染促進caco-2細胞c-Jun表達上調，促進caco-2細胞DNA復制，且Fn感染對DNA復制的促進作用與高表達c-Jun顯著相關，Fn感染促進c-Jun的表達可能與p-catenin信號通路激活有關。但是c-Jun同時也是MAPK信號通路中的下游靶基因，本實驗中尚未檢測Fn感染caco-2細胞后p-catenin的表達情況，也并未進行P-catenin特異性si-RNA轉染實驗檢測c-Jun表達，以確定Fn感染后高表達c-Jun與p-catenin的直接聯(lián)系?！鞠嚓P文獻】[1]KosticAD,GeversD,PedamalluCS,etal.GenomicanalysisidentifiesassociationofFusobacteriumwithcolorectalcarcinoma[J].GenomeRes,2012,22(2):292-298.[2]GaudioE,PalamarchukA,PalumboT,etal.PhysicalassociationwithWWOXsuppressesc-Juntranscriptionalactivity[J].CancerRes,2006,66(24):11585-11589.[3]TurpaevKT.RoleoftranscriptionfactorAP-1inintegrationofcellularsignallingsystems[J].MolBiol(Mosk),2006,40(6):945-961.[4]O’ConnorPM,LapointeTK,BeckPL,etal.Mechanismsbywhichinflammationmayincreaseintestinalcancerriskininflammatoryboweldisease[J].InflammBowelDis,2010,16(8):1411-1420.[5]Viaud,SaccheriF,MignotG,etal.Theintestinalmicrobiotamodulatestheanticancerimmuneeffectsofcyclophosphamide[J].Science,2013,342(6161):971-976.[6]HanYW.Commentary:Oralbacteriaasdriversforcolorectalcancer[J].JPeriodontol,2014,85(9):1155-1157.[7]FlanaganL,SchmidJ,EbertM,etal.Fusobacteriumnucleatumassociateswithstagesofcolorectalneoplasiadevelopment,colorectalcanceranddiseaseoutcome[J].EurJClinMicrobiolInfectDis,2014,33(8):1381-1390.[8]BhattacharyyaS,GhoshSK,ShokeenB,etal.FAD-I,afusobacteriumnucleatumcellwall-associateddiacylatedlipoproteinthatmediateshumanbetadefensin2in