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仿刺參補(bǔ)體AjC3部分基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備補(bǔ)體C3(AjC3)在仿刺參的固有免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色,是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最高的組成成分。補(bǔ)體AjC3產(chǎn)生的一系列裂解物C3a,C3b等能調(diào)節(jié)仿刺參免疫系統(tǒng)。補(bǔ)體AjC3還能夠通過形成溶膜復(fù)合物清除靶細(xì)胞。目前還沒有檢測(cè)仿刺參補(bǔ)體AjC3比較靈敏的工具。本實(shí)驗(yàn)的目的是克隆AjC3部分基因片段,原核表達(dá)并純化重組蛋白,制備補(bǔ)體AjC3的多克隆抗體,為進(jìn)一步研究仿刺參補(bǔ)體AjC3的免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增AjC3基因片段,將該片段與表達(dá)載體pGS-21a連接,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Transetta(DE3)中,在不同溫度,時(shí)間,IPTG濃度下誘導(dǎo)表達(dá)。超聲破碎后,SDS分析重組蛋白的表達(dá)形式。表達(dá)的重組蛋白經(jīng)鎳柱純化后,作為抗原免疫小鼠制備AjC3多克隆抗體。間接ELISA檢測(cè)抗體的效價(jià),Westernblot檢測(cè)抗體的特異性及AjC3蛋白在各組織中的分布。PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度分別為1185bp(1d),873bp(2d),555bp(3d)的目的片段;基因測(cè)序證明成功的構(gòu)建了pGS-21a-1d,pGS-21a-2d,pGS-21a-3d重組質(zhì)粒;其中pGS-21a-1d未表達(dá)蛋白質(zhì),pGS-21a-2d,pGS-21a-3d最佳誘導(dǎo)條件是30℃,0.2mmol/LIPTG,誘導(dǎo)6h;SDS分析表明pGS-21a-2d,pGS-21a-3d均以包涵體的形式表達(dá)。鎳柱純化后重組蛋白純度達(dá)到90%,pGS-21a-2d表達(dá)的重組蛋白分子量約為67KDa,pGS-21a-3d表達(dá)的重組蛋白分子量約為56KDa;間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)分別為1:400,1:25600;Westernblot結(jié)果顯示多克隆抗體具有良好的特異性,AjC3蛋白在體腔液及體壁中均有分布。構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGS-21a-1d,pGS-21a-2d,pGS-21a-3d;純化獲得了重組蛋白;成功制備了具有高效價(jià)和特異性的補(bǔ)體AjC3多克隆抗
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