轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)的鑒定課件

轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)的鑒定組員：魏翠芳、楊帆、甘小東、孫圓圓、

王翠華、張輝、曹盼、王凱、羅青幫田曉瑞、馬小莉、王亞平、袁源轉(zhuǎn)基因技術(shù)將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenetechnology）。技術(shù)路線目的基因分離植物表達(dá)載體的構(gòu)建受體材料的準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化組織組織脫分化轉(zhuǎn)化植株篩選煉苗1.目的基因的分離（1）已知基因的獲得①化學(xué)合成法②PCR擴(kuò)增（2）未知基因的獲得①構(gòu)建基因組文庫，篩選目的基因②構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因③mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因④差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)技術(shù)篩選功能基因……①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①銀杏葉RNA提取②反轉(zhuǎn)錄cDNA③chs全長(zhǎng)cDNA的克?、躎A克隆及測(cè)序⑤向chs兩端引入酶切位點(diǎn)⑥雙酶切⑦定向克隆⑧導(dǎo)入農(nóng)桿菌

2.植物表達(dá)載體的構(gòu)建3.受體材料的準(zhǔn)備細(xì)胞的全能性：分化細(xì)胞脫分化再分化

但進(jìn)去的DNA片段整合效率極低，不易獲得再生植株，可能發(fā)生共抑制現(xiàn)象.基因槍轉(zhuǎn)化法由美國(guó)Cornell大學(xué)的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢?；蚪鹆?表面,通過高壓驅(qū)動(dòng)力加速微粒穿透植物細(xì)胞壁,導(dǎo)入受體組織細(xì)胞內(nèi),然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后,整合到染色體上并得到表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化.。電擊法的主要原理是將原生質(zhì)體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質(zhì)體膜的某些部位被擊穿而產(chǎn)生可回復(fù)的小孔,外源DNA可通過小孔進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi),而且不影響經(jīng)電擊處理的原生質(zhì)體再生植物的能力.轉(zhuǎn)化效率較低，且僅限于能由原生質(zhì)體再生出植株的植物?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ抢瞄_花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化.PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子.PEG可促使細(xì)胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細(xì)胞間的識(shí)別,利于細(xì)胞膜間的融合以及外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體.表1幾種植物轉(zhuǎn)基因方法比較

轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)化的缺點(diǎn)DNA間接轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移受體種類，可以在原生質(zhì)體、蛋細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)、組織器官或整株等多級(jí)水平上進(jìn)行，方法成熟可靠，簡(jiǎn)便易行，周期短，轉(zhuǎn)化率高；轉(zhuǎn)化雙子葉植物為主。大多數(shù)單子葉植物和裸子植物對(duì)農(nóng)桿菌的侵入不敏感，限制了該法在禾谷類作物中的應(yīng)用。轉(zhuǎn)化體常出現(xiàn)“嵌合”現(xiàn)象，需在嚴(yán)格條件下加以選擇以淘汰未轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA直接轉(zhuǎn)化法（1）基因槍轉(zhuǎn)化法（2）電擊法（3）PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化法（4）花粉管通道法無宿主限制，適用于各種單、雙子葉植物，操作簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)化效率低，需要專門設(shè)備（電擊儀、顯微操作儀或基因槍），多數(shù)需要原生質(zhì)體與愈傷組織，周期太長(zhǎng)（電擊法）5.轉(zhuǎn)化組織——農(nóng)桿菌介導(dǎo)之葉盤轉(zhuǎn)化法帶有轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌活化受體植物葉盤侵染共培養(yǎng)篩選培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗預(yù)培養(yǎng)葉盤，或愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化主要的影響因素：1.預(yù)培養(yǎng)時(shí)間：一般0~3天，過長(zhǎng)不利于侵染2.農(nóng)桿菌濃度：用MS（pH=7.0）鹽溶液調(diào)OD值（一般在0.2~1.0）3.侵染時(shí)間：時(shí)間應(yīng)適中，太短轉(zhuǎn)化率低；太高則后期農(nóng)桿菌難以除凈，毒害材料。4.共培養(yǎng)時(shí)間5.乙酰丁香酮（AS）處理：處理方式及濃度(A)僅共培養(yǎng)基中加AS(B)僅菌液中加AS(C)菌液和共培養(yǎng)基中均加ASAS使用濃度：50μM~200μM實(shí)驗(yàn)結(jié)論：A與C效果最好且差異不明顯6.煉苗7、轉(zhuǎn)基因植物的鑒定個(gè)體水平鑒定個(gè)體水平上鑒定利用遺傳學(xué)和育種學(xué)方法，即種植或誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)其性狀特征或生理特征。細(xì)胞和組織水平鑒定報(bào)告基因：指其編碼產(chǎn)物能夠被快速的測(cè)定，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞（器官或組織）并檢測(cè)其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因。一個(gè)理想的報(bào)告基因，最基本的要求是在轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞中應(yīng)不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性，其表達(dá)產(chǎn)物不僅不會(huì)損害寄主細(xì)胞，而且應(yīng)該快速、靈敏、定量和可重復(fù)的檢測(cè)特性。1.綠色熒光蛋白（GFP）基因特點(diǎn)：可在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀中直接觀察基因的表達(dá)。2.氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因

缺點(diǎn)：信號(hào)沒有NPT-II強(qiáng)優(yōu)點(diǎn)：克服了受體細(xì)胞非特異性酶本底較高的缺點(diǎn)，且CAT酶定量分析很準(zhǔn)確。3.β-葡萄糖酸苷酶（GUS）基因GUS基因所編碼的β-葡萄糖酸苷酶可催化裂解人工合成的底物4-甲基傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮，可用熒光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定。其它報(bào)告基因熒光素酶（LUC）基因二氫葉酸還原酶（DHFR）基因抗除草劑Basta（bar）基因胭脂堿、章魚堿基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT-Ⅱ）基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）雜交鑒定

外源基因整合的Southern雜交鑒定

外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測(cè)

外源基因表達(dá)蛋白的檢測(cè)

外源基因整合及表達(dá)的原位雜交檢測(cè)Southern雜交過程8.轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用植物基因改良

抗蟲害植物、抗除草劑植物、高品質(zhì)植物轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物轉(zhuǎn)基因植物富含維他命A的黃金大米轉(zhuǎn)基因棉花（Bt基因）抗蟲玉米轉(zhuǎn)基因番茄（抗花葉病基因）1983年美國(guó)和比利時(shí)科學(xué)家首次將外源基因?qū)霟煵莺秃}卜。1994年世界上第一種耐儲(chǔ)藏的番茄在美國(guó)批準(zhǔn)上市。1995年轉(zhuǎn)基因的抗蟲、抗除草劑的玉米和棉花在美國(guó)投入生產(chǎn)。2000年美國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積首次超過普通大豆。迄今為止世界上共批準(zhǔn)了12種作物、6大類性狀的48個(gè)轉(zhuǎn)基因品種進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，其中包括水稻、玉米、馬鈴薯、小麥、黑麥、紅薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亞麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡蘿卜、黃瓜、蘆筍、苜蓿、草莓、木瓜、獼猴、桃、越橘、茄子、梨、蘋果、葡萄等。應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因藥物的植物藥物名稱基因來源應(yīng)用植物載體核糖體抑制蛋白恬樓、玉米抑制HIV煙草血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶牛奶抗過敏煙草、番茄抗體老鼠多種用途煙草抗原細(xì)菌、病毒病原口