納米三氧化二鋁薄膜對(duì)成骨細(xì)胞的影響課件

納米多孔Al2O3薄膜對(duì)成骨細(xì)胞的影響OsteogenicdifferentiationofmarrowstromalcellsculturedonnanoporousaluminasurfacesPublishedonline6November2006inWileyInterScience().文獻(xiàn)出處目

錄簡(jiǎn)介材料和方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)論簡(jiǎn)介用于骨科整形的生物材料面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)就是設(shè)計(jì)材料表面能夠滿足以下兩個(gè)條件：允許依賴錨定的成骨細(xì)胞的粘附；提高成骨細(xì)胞的分化能力，從而使成熟的成骨細(xì)胞群體能夠在適當(dāng)?shù)纳锊牧媳砻婵焖俚匦纬梢粋€(gè)界面層。影響骨植入界面的重要相關(guān)參數(shù)有表面成分，表面能，表面粗糙度和表面形貌。研究者已經(jīng)證明將材料表面控制在微米或納米范圍內(nèi)可以改變各種類型細(xì)胞的分化程度。骨有一系列分等級(jí)的結(jié)構(gòu)包括宏觀結(jié)構(gòu)，微觀結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)。因此，材料表面有等級(jí)的形貌，類似于骨的分級(jí)結(jié)構(gòu)，將誘導(dǎo)不同的生物反應(yīng)。本文論述納米級(jí)的形貌對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響。通過檢測(cè)得知堿性磷酸酶（ALP）的活性和基質(zhì)產(chǎn)量增多。Klawitter

和Hulbert[1]

使用氧化陶瓷，證明了孔徑為100μm的多孔表面對(duì)于合適的骨內(nèi)生是必須的。Bobyn

等[2]使用金屬植入管，當(dāng)孔徑在50-400μm之間表現(xiàn)出良好的骨內(nèi)生性。研究顯示[3]在高密度的氧化金屬層上的更小的孔徑能允許骨的長(zhǎng)入。例如，在外科手術(shù)2-3周后，Ca–P涂層的多孔植入管和人骨展現(xiàn)出了相同的骨內(nèi)生性。在一項(xiàng)研究中，隨著納米氧化鋁顆粒從167nm降到24nm，成骨細(xì)胞的粘附增加50%。與常見孔徑（微米級(jí)）的氧化鋁相比，細(xì)胞的增殖能力，堿性磷酸酶的活性，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)量都有明顯的增加。已

做

實(shí)

驗(yàn)[1]KlawitterJJ,HulbertSF.Applicationofporousceramicsfortheattachmentofloadbearinginternalorthopedicapplications.JBiomedMaterSymp1972;2:161–229.[2]BobynJD,PilliarRM,CameronHU,WeatherlyGC.Theoptimumporesizeforthefixationofporous-surfacedmetalimplantsbytheingrowthofbone.ClinOrthopRelatRes1980;150:263–270.[3]LeeTM,WangBC,YangYC,ChangE.Comparisonofplasma-sprayedhydroxyapatitecoatingsandhydroxyapatite/tricalciumphosphatecompositecoatings:Invivostudy.JBiomedMaterRes2001;55:360–367.圖一電化學(xué)拋光裝置（10～15min）磷酸和硫酸混合液（80～90℃）圖二鋁陽極氧化實(shí)驗(yàn)裝置(60～300min)草酸溶液(0.2～0.5mol/L)（冰?。?0～50V圖三納米多孔氧化鋁的掃描電鏡圖（孔徑為79nm）

細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備Jackson實(shí)驗(yàn)室的C57BJ小鼠

處死，取下脛骨和股骨切除兩端干骺端，顯露骨髓腔10mL注射器內(nèi)吸入改良的MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔內(nèi)容物70μm的尼龍過濾器

納米多孔氧化鋁薄膜放在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板里加上蓋子在紫外光下預(yù)消毒24小時(shí)薄膜浸在70%的乙醇中消毒30分鐘將密度為15-25×106/孔的骨髓基質(zhì)細(xì)胞和消毒過的納米多孔薄膜一起放在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板里

無定形態(tài)的氧化鋁薄膜作為對(duì)照試驗(yàn)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)量評(píng)估方向1細(xì)胞粘附和增殖2細(xì)胞生存能力細(xì)胞功能3456堿性磷酸酶（ALP）活性細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的密度為15×106細(xì)胞/孔。在培養(yǎng)一天后，用胰蛋白酶處理，使細(xì)胞分離，觀察細(xì)胞的粘附情況，培養(yǎng)四天和七天后觀察其增殖能力，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。細(xì)胞粘附和增殖

將粘附在氧化鋁薄膜上的細(xì)胞用Calcein-AM著色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的酯酶活性。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細(xì)胞膜，在活細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下，脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光，從而反映酯酶的活性。

細(xì)胞功能用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)其生存能力。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能打開四唑環(huán)，使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞生存能力堿性磷酸酶（ALP）活性(細(xì)胞培養(yǎng)三周后檢測(cè))在室溫下，用混有2%的多聚甲醛的熱的PBS溶液沖洗細(xì)胞三次細(xì)胞固定好之后，向25mL去離子水中加入25mL堿性緩沖溶液制成堿性磷酸酶作用物溶液充分沖洗每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)加入1mL堿性磷酸酶作用物溶液在37℃條件下反應(yīng)30分鐘

移去0.5mL的溶液同時(shí)加入0.5mLNaOH終止反應(yīng)通過測(cè)定在410nm處吸光度的變化速率來計(jì)算ALP的活性對(duì)硝基苯磷酸二鈉+H2O堿性磷酸酶對(duì)硝基苯酚+H3PO4細(xì)胞外基質(zhì)(細(xì)胞培養(yǎng)三周后)鈣和磷是骨基質(zhì)的主要成分，一旦細(xì)胞在材料表面開始分化，它們將沉積骨基質(zhì)。從細(xì)胞培養(yǎng)板上取出樣品風(fēng)干，進(jìn)行XPS分析檢測(cè)鈣和磷的含量。

XPS（X射線光電子能譜）的原理是用X射線去輻射樣品，使原子或分子的內(nèi)層電子或價(jià)電子受激發(fā)射出來。被光子激發(fā)出來的電子稱為光電子?？梢詼y(cè)量光電子的能量，以光電子的動(dòng)能為橫坐標(biāo)，相對(duì)強(qiáng)度（脈沖/s）為縱坐標(biāo)可做出光電子能譜圖。根據(jù)能譜圖中光電子譜線強(qiáng)度（光電子峰的面積）反應(yīng)原子的含量或相對(duì)濃度。細(xì)胞形態(tài)在細(xì)胞培養(yǎng)三周后，用掃描電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。

細(xì)胞固定，脫水用PBS溶液沖洗2次在含有3%的戊二醛，0.1M的甲胂酸鈉，0.1M的蔗糖的定影劑中浸泡45分鐘

用含有0.1M的甲胂酸鈉和0.1M的蔗糖的緩沖液沖洗兩次，每次5分鐘

依次用35%，50%，70%，95%和100%的乙醇脫水細(xì)胞各10分鐘用六甲基二硅烷浸泡細(xì)胞十分鐘，使細(xì)胞干燥。然后倒掉六甲基二硅烷，使材料表面風(fēng)干30分鐘將材料表面鍍上一層10nm的金，掃描電鏡電壓設(shè)置為10-20kV

結(jié)果細(xì)胞粘附和增殖細(xì)胞生存能力細(xì)胞功能堿性磷酸酶活性細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)圖四為用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)得的細(xì)胞在納米多孔氧化鋁和無定形態(tài)氧化鋁表面的粘附（培養(yǎng)1天后）和增殖（培養(yǎng)4天和7天后）能力。

結(jié)果顯示，與無定形態(tài)氧化鋁相比，納米多孔氧化鋁表面(n=3，p<0.01)的細(xì)胞的粘附和增殖能力更強(qiáng)。細(xì)胞粘附和增殖細(xì)胞生存能力圖五為MTT分析在納米多孔和無定形態(tài)氧化鋁表面細(xì)胞（培養(yǎng)1天和4天時(shí)）中的甲瓚的吸光度。結(jié)果顯示細(xì)胞在納米多孔氧化鋁（n=3，p<0.01）表面活細(xì)胞數(shù)更多，即具有更高的生存能力。細(xì)胞的功能圖六為在材料表面的被Calcein-AM著色的活細(xì)胞圖(10×)。細(xì)胞在無定形態(tài)氧化鋁表面為球形的，而在納米氧化鋁表面為展開狀態(tài)。堿性磷酸酶活性圖七為無定形態(tài)和納米多孔氧化鋁表面細(xì)胞（培養(yǎng)2和3周后）的堿性磷酸酶活性測(cè)定，通過測(cè)定在410nm處對(duì)硝基苯酚吸光度的變化速率來計(jì)算ALP的活性，結(jié)果顯示培養(yǎng)在納米多孔氧化鋁(n=3，p<0.01)表面的細(xì)胞有更高的堿性磷酸酶活性。細(xì)胞外基質(zhì)Ca/AlP/Al納米多孔無定形態(tài)納米多孔無定形態(tài)第2周0.37±0.0020.13±0.0020.45±0.0010.21±0.003第3周0.46±0.0030.21±0.0010.72±0.0020.33±0.003表一XPS分析檢測(cè)納米多孔和無定形態(tài)氧化鋁表面細(xì)胞的鈣和磷濃度與無定形態(tài)氧化鋁相比，在納米多孔氧化鋁表面，每周的鈣和磷比例都比較高。說明在納米多孔氧化鋁表面的成骨細(xì)胞產(chǎn)生更多的細(xì)胞外基質(zhì)（p＜0.01）。>>成骨細(xì)胞形態(tài)（1周后）圖八掃描電鏡圖像顯示細(xì)胞在培養(yǎng)1周后粘附情況，與無定形態(tài)氧化鋁相比，細(xì)胞在納米多孔氧化鋁表面聚集并呈現(xiàn)展開的形態(tài)，說明細(xì)胞對(duì)納米結(jié)構(gòu)更適應(yīng)。AmorphousNanoporous成骨細(xì)胞形態(tài)（2周后）AmorphousNanoporous圖九細(xì)胞(培養(yǎng)2周后)在無定形態(tài)和納米多孔氧化鋁表面的掃描電鏡圖像。細(xì)胞在納米多孔氧化鋁表面進(jìn)行延伸，進(jìn)入分化階段，而在無定形態(tài)氧化鋁表面呈球形。

成骨細(xì)胞形態(tài)（3周后）NanoporousAmorphous圖十在培養(yǎng)3周后，納米多孔氧化鋁表面增殖的細(xì)胞通過儲(chǔ)存基質(zhì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而在無定形態(tài)氧化鋁表面無此網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)論設(shè)計(jì)一種與成骨細(xì)胞有良好反應(yīng)的材料對(duì)于整形外科生物材料研