小麥原生質(zhì)體分離及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法

小麥原生質(zhì)體分離及轉(zhuǎn)化1.需要準(zhǔn)備的器材名稱(chēng)名稱(chēng)名稱(chēng)剃須刀片100um尼龍膜0.45um濾膜玻璃皿血球計(jì)數(shù)板真空泵及適配器70mm培養(yǎng)皿或100ml錐形瓶名稱(chēng)名稱(chēng)名稱(chēng)剃須刀片100um尼龍膜0.45um濾膜玻璃皿血球計(jì)數(shù)板真空泵及適配器70mm培養(yǎng)皿或100ml錐形瓶離心機(jī)(水平轉(zhuǎn)子)濾布圓周搖床2ml圓底管10/50ml注射器六孔板50ml圓底離心管六孔板材料準(zhǔn)備小麥苗的培養(yǎng)，種小麥種子于培養(yǎng)室，置于溫度25±2°C，光照度1000Lx,光照14?16h/d的條件下培養(yǎng)。先光照培養(yǎng)7天再暗培養(yǎng)7-10天。原生質(zhì)體分離取小麥幼嫩的葉片，用刀片將其中間部分切成0.5-1mm的絲，放入0.6M的Mannitol溶液中避光處理10分鐘，再用濾網(wǎng)過(guò)濾，將其放入50ml酶液中消化5小時(shí)(先靜止酶解0.5h，再10rmp緩慢搖晃4.5h)。(注：酶解溫度要保持在20-25°C，且要避光，酶解完輕輕搖晃酶解液，使原生質(zhì)體釋放出來(lái)。)加10mlW5稀釋酶解產(chǎn)物，用100um尼龍濾膜過(guò)濾酶解液于圓底離心管中(50ml)。(注：尼龍濾膜要浸泡在75%酒精里，用時(shí)要用水沖洗，再用W5浸泡2min再過(guò)濾。)23C，80g，升3降3，離心3min，棄上清。(注：離心機(jī)需采用水平轉(zhuǎn)子，且升降速不可超過(guò)3，否則細(xì)胞可能破碎，以下所有離心步驟均需采用此設(shè)置。)用W510ml輕輕懸起，23C，80g，升3降3，離心3min，棄上清。用W510ml輕輕懸起冰上放置30min，原生質(zhì)體逐漸沉降，23C，80g，升3降3，離心3min，棄上清。加適量MMG懸浮，至于冰上，待轉(zhuǎn)化。(注：此時(shí)需要確定原生質(zhì)體的濃度，鏡檢(X100),原生質(zhì)體數(shù)為2X105/ml---1X106/ml.吸取原生質(zhì)體所用槍頭均需剪去槍頭尖以防其對(duì)細(xì)胞造成傷害。)小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化加20ug質(zhì)粒于10ml離心管，用去尖的槍頭吸取200ul原生質(zhì)體輕彈混勻，靜止3-5min，再加200ulPEG4000，輕彈混勻，避光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化10min；加1760ulW5(室溫)顛倒混勻，80g，升3降3，離心3min，棄上清；加1mlW5，顛倒混勻，輕輕轉(zhuǎn)至6孔板中，已預(yù)先加入1mlW5,23°C培養(yǎng)過(guò)夜。6孔板先使用5%NBS包被。溶液配制酶解液：(1.5%CellulaseR-10,0.3%MacerozymeR-10,0.6Mmannitol,10mMMESatpH5.7,1mMCaCl2and0.1%BSA)W5：(154mMNaCl,125mMCaCl2,5mMKCland4mMMESatpH5.7)MMG:(0.4Mmannitol,15mMCaCl2and4mMMESatpH5.7)PEG：(40%(W/V)PEG4000;Fluka,0.2Mmannitoland0.1MCaCl2)具體配置如下：(1)50ml酶解液(現(xiàn)用現(xiàn)配)試劑加入量終濃度CellulaseR100.75g1.5%MacerozymeR100.375g0.75%Mannitol5.4651g0.6MMES0.1066g10mM定容至50ml，KOH調(diào)pH值為5.7；55C水浴10分鐘，室溫自然冷卻后再加CaCl20.0735g10mMBSA0.05g0.1%用0.45um濾膜過(guò)濾(2)500mlW5試劑加入量終濃度

NaCl4.5g154mMCaCl29.189g125mMKCl0.1864g5mMMES0.2132g2mM定容至500ml,NaOH調(diào)pH為5.7(3)250mlWI試劑加入量終濃度Mannitol22.77g(MW182.17)0.5MKCl0.3728g20mMMES0.2132g4mM定容到250ml,KOH調(diào)pH至5.7，用0.45um濾膜過(guò)濾（4）10mlMMG溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）試劑加入量終濃度Mannitol(0.8M)5ml0.4MMgCl2(1M)0.15ml15mMMES(200mM)0.2ml4mMDDW定容至10ml（5）4mlPEG溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）試劑加入量終濃度PEG40001.6g40%Mannitol(0.8M)1ml0.2MCaCl2(1M)0.4ml0.1MDDW定容至4ml（5）母液配制（100ml，4°C）

名稱(chēng) 稱(chēng)取試劑量（100mL）分子量（MW）0.8MMannitol 14.5736g182.172