淺談色譜柱基礎知識

淺談色譜柱基礎知識北京鴻作盛威科技有限公司長期致力于色譜分析方法的建立、應用與推廣，幫助客戶儀器選型、建立色譜分析方法、培訓操作人員，為客戶提供各種分析儀器應用、維修等技術咨詢服務，公司與多家國內(nèi)外儀器廠商達成合作，擴展服務項目，滿足客戶的需求?，F(xiàn)將氣相色譜儀在應用過程中主要配件色譜柱的基礎知識做以下介紹：色譜柱組成色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。二、色譜柱簡介色譜柱可分為\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"填充柱和開管柱兩大類。多為金屬或\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"玻璃制作。有直管形、\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"盤管形、\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"U形管等形狀。\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"液相色譜通常均采用填充柱。1.\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"制備和操作條件。2.色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"氧化鋁、有機聚合物微球（包括\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。3.柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"管壁效應。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。三、色譜柱安裝安裝1.首先應確認柱和儀器的接頭以及管路是否匹配。為減少\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"死體積，進樣閥、柱子、\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"檢測器之間的連接管路內(nèi)徑盡可能使用內(nèi)徑較小的管線，同時控制\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"進樣器、色譜柱和檢測器之間連接管線的長度。安裝色譜柱之前，確認流路系統(tǒng)中的溶劑是否正常。對分析較復雜的樣品建議安裝\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"保護柱。2.為了使色譜柱與儀器系統(tǒng)達最佳的連接效果，應盡量使用與色譜柱接口相匹配的螺帽和錐形接頭，如原來的接頭長期匹配其他類型的色譜柱，建議在連接新色譜柱前應檢查匹配情況，避免造成色譜柱的損壞或因色譜柱不匹配造成的\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"漏液。3.使用PEEK材料的通用接頭，只需用手擰緊不需要特定扳手，使用壓力為5000psi；使用溫度不得超過100℃。流動相1.在進行樣品檢測前，至少使用20倍\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"柱體積流動相使色譜柱充分平衡。流動相一定要使用色譜級別的溶劑。如使用\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"水相的緩沖液應當天配制以保持新鮮避免細菌產(chǎn)生。2.\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"流動相使用前需用微孔濾膜過濾,消除流動相中顆粒對色譜系統(tǒng)和色譜柱的損壞。緩沖液與其他流動相混合后應重新過濾避免溶解度變化造成產(chǎn)生新的沉淀。不應使用純水作為流動相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞（添加5%的有機溶劑沖洗色譜柱，同時可以達到對緩沖鹽清洗的作用。還可以使色譜柱更容易平衡）。3.流動相需脫氣后使用，可避免因氣泡導致的泵和檢測器的工作不正常。如果測試時使用的流動相與色譜柱保存使用的流動相有較大區(qū)別，應該使用過度分布的形式進行平衡。避免由于\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"流動相的突然變化造成柱壓增加過大或流動相緩沖鹽結晶造成對色譜柱和儀器系統(tǒng)的損壞。\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"正相色譜柱比\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"反相色譜柱需要更長的平衡時間。樣品制備1.樣品應當盡可能溶解在能與流動相相互溶的溶劑中。除特殊指明外，如使用強溶劑溶解樣品柱子的分辨率將可能降低。2.\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"樣品溶液在進樣前應使用針頭式過濾器對樣品預先過濾。頻繁改變\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"流動相組成，會加速降低柱效。3.色譜柱由高壓勻漿法裝填，能承受較高壓力。為獲得最佳分離效果，使用時請不要超過200kgf，而且避免壓力突然上升或變化，否則會造成硅膠填料的破壞，減少色譜柱的使用壽命。除特殊要求外最高操作溫度不要超過60℃。保存操作1.如果流動相含有酸或無機鹽，應當先用去離子水（20倍柱體積）沖洗干凈。然后用用100\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"乙腈或甲醇保存色譜柱。最后用柱子的接頭密封，并放在穩(wěn)定的環(huán)境中存放。2.應避免色譜柱受到直接的\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"機械沖擊或摔落，避免造成色譜柱性能的降低。色譜柱的再生1.用相當于20倍柱體積的溶劑按下列順序沖洗柱子，建議按柱子的箭頭方向沖洗，盡可能不反沖。沖洗時使用的的參考溶劑順序是水、甲醇、氯仿、異丙醇。四、色譜柱注意事項色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。

1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應該緩慢進行，在\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"閥進樣時閥的轉動不能過緩2.應逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"反相色譜中，不應直接從\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。4.選擇使用適宜的\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。5.避免將基質(zhì)復雜的\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。6.經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。7.保存色譜柱時應將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。8.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護、延長\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"柱壽命的作用。采用\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后，可能有一些\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F%B1/_blank"吸附作用強的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補加填料使柱效恢復。每次工作完后，最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽\t"/item/%E8%89%B2%E8%B0%B1%E6%9F