【生物課件】植物DNA、RNA及蛋白提取與分析互聯(lián)網(wǎng)資料

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植物DNA、RNA及蛋白的提取與分析

植物DNA提取

DNA提取原則

保證DNA結(jié)構(gòu)的完整性排解有機(jī)溶劑和金屬離子的污染排解其它核酸分子的污染蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等降低到最低程度純化后不應(yīng)存在對(duì)酶抑制性的物質(zhì)

植物DNA提取的方法

CTAB法SDS法煮提法

--植物DNA提取的經(jīng)典方法

DNA提取的基本步驟

材料的預(yù)備(新奇或冷凍保存)細(xì)胞的裂解(液氮研磨，釋放內(nèi)容物)DNA的分別與純化(酚氯仿抽提)DNA的沉淀與洗滌(2V無(wú)水乙醇或2/3V異丙醇)DNA的干燥與溶解(ddH2O或TE)

CTAB法流程植物材料裂解液沉淀

液氮研磨

抽提

離心洗滌

細(xì)胞裂解

上層溶液

干燥溶解

CTAB提取液主要成分CTAB:十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇或異丙醇沉淀即可使核酸分別出來(lái)。

Tris-HCl(pH8.0):供應(yīng)一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。EDTA:螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性。NaCl:供應(yīng)一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中。

CTAB法步驟1.取約0.1g的水稻葉片在液態(tài)中磨成粉末，將適量的粉末材料轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中。2.加入600l預(yù)熱(95℃)的1.5CTAB緩沖液，然后65℃溫浴20~60min。3.取出EP管，冷卻后加入600l氯仿:異戊醇(24:1)混合勻稱，然后10000rpm離心10min,取出后吸取上清液到另一新的EP管中。4.加入2/3V異丙醇或2V無(wú)水乙醇混合勻稱，冰浴至DNA絲狀物消失。5.略微離心沉淀DNA,倒掉上清液。6.加入600l75%乙醇洗滌，放臵30min。7.倒掉上清液，室溫下吹干DNA。8.加入100lTE溶解DNA。9.取5-10ul電泳檢測(cè)提取效果10.-20℃下貯存?zhèn)溆?/p>

留意事項(xiàng)

1.全部用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。2.全部試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。3.在提取過(guò)程，應(yīng)盡量在溫柔的條件下操作,如盡量削減酚/氯仿抽提、混勻過(guò)程要輕緩,以保證得到較長(zhǎng)的DNA。

DNA的質(zhì)量檢測(cè)

電泳帶型單一無(wú)拖尾現(xiàn)象點(diǎn)樣孔無(wú)殘留雜質(zhì)OD值測(cè)定DNA純品的OD260/OD280為1.8,若比值較高說(shuō)明含有RNA,比值較低說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說(shuō)明有殘余的鹽存在。

植物RNA提取

分別RNA的目的

RT-PCRNorthernblot構(gòu)建cDNA文庫(kù)GeneChips體外翻譯

RNA提取的關(guān)鍵--防止RNase降解RNA

試驗(yàn)失敗的主要緣由是RNA酶的污染。RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要幫助因子。討論人員的手、唾液、灰塵、器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、各種試劑及各種組織

和細(xì)胞中。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過(guò)程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在試驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格掌握外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。

防止RNase污染的措施1.耐高溫的器具(如玻璃制品、研缽、剪刀、鑷子等)于180℃下干烤8h2.塑料耗材(Tip、EP管等)用0.1%的DEPC水浸泡過(guò)夜，然后高壓，再烤干備用3.試驗(yàn)用的氯仿、乙醇為RNA專(zhuān)用，水為DEPC處理水4.使用有效的RNase抑制劑：如異硫氫酸胍、RNasin5.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制6.試驗(yàn)過(guò)程需帶一次性塑料手套且常常更換7.設(shè)臵RNA操作專(zhuān)用試驗(yàn)室，全部器械等應(yīng)為專(zhuān)用。留意：DEPC有致癌之嫌，必需當(dāng)心操作，防止接觸與吸入！

常用的RNase抑制劑

DEPC(焦磷酸二乙酯):是一種劇烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。異硫氫酸胍∶目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有劇烈的變性作用。RNasin(RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑)一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活氧釩核糖核苷復(fù)合物:由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。其它：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有肯定抑制作用。

分別總RNA的方法1.胍鹽法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和-巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)酚氯仿抽提后再沉淀。2.氯化鋰沉淀法：由于鋰在在肯定pH下能使RNA相對(duì)特異地沉淀，但簡(jiǎn)單使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對(duì)mRNA有抑制作用。3.苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA。

TRIReagent提取總RNATRIReagent含有異硫氰酸胍和苯酚，能夠有效溶解RNA,DNA和蛋白質(zhì)。在加入氯仿并離心后，上層水相中含有RNA。水相的RNA經(jīng)過(guò)沉淀和洗滌后幾乎沒(méi)有DNA或者蛋白質(zhì)污染

TRIReagent提取步驟1.研缽研杵預(yù)冷后,加入少量樣品用液N快速研磨成冰粉狀2.將樣品(樣品量不超過(guò)100mg)移入1.5mlEP管中,快速加入1mlTRIReagent混勻,室溫靜臵5min3.加0.2ml氯仿,猛烈振蕩15S,室溫靜臵10min4.4℃,120

00g,15min;取上清于另一EP管中，加0.5ml異丙醇混勻，室溫靜臵10min5.4℃,12000g,8min;去上清，加1ml75%乙醇，渦漩沉淀6.去75%乙醇，室溫晾干5~10min7.加30~50ulDEPC-H2O溶解8.電泳檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量

留意事項(xiàng)

材料新奇，冷凍材料切忌反復(fù)凍融，如要多次提取，分成多份保存(液氮長(zhǎng)期保存，-70℃短期保存)先用液氮研磨植物材料，研