動(dòng)物源奇異變形桿菌NDM耐藥基因定位檢測(cè) Southern印跡雜交法

動(dòng)物源奇異變形桿菌blaNDM耐藥基因定位檢測(cè)Southern印跡雜交法本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物源奇異變形桿菌blaNDM耐藥基因定位檢測(cè)Southern印跡雜交法。本文件適用于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物源奇異變形桿菌blaNDM耐藥基因定位檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T2552.8-2010乳及乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法第8部分：普通變形桿菌和奇異變形桿菌檢驗(yàn)3術(shù)語(yǔ)和定義、符號(hào)和縮略語(yǔ)以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1SeaKemGoldAgarose一種高凝膠強(qiáng)度，適用于脈沖場(chǎng)凝膠電泳法快速分辨50Kb-10MbDNA和常規(guī)電泳方法分辨1-50KbDNA與PCR產(chǎn)物。因其低電滲（EEO）特性，SeakemGoldAgarose中的DNA電泳遷移速度顯著高于常規(guī)瓊脂糖凝膠。PFGE跑膠時(shí)間依使用緩沖液和瓊脂糖濃度的不同可減少至原電泳時(shí)間的50%。3.2XbaI酶一種限制性內(nèi)切酶，該限制性內(nèi)切酶識(shí)別5'-T|CTAGA-3'的酶切位點(diǎn)。3.3S1核酸酶一種高度單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，源于稻谷曲霉，在最適的酶催反應(yīng)條件下，降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5'-磷酸的單核苷酸或寡核苷酸。4原理Southern印跡雜交是利用S1核酸酶將環(huán)狀質(zhì)粒切開(kāi)成為線性雙鏈DNA，利用PFGE脈沖電泳將染色體DNA與質(zhì)粒線性雙鏈DNA進(jìn)行電泳分離。在PFGE電泳圖上顯示線性質(zhì)粒DNA為清晰的條帶，而降解的染色體DNA則顯示為模糊的彌散帶。由于線性質(zhì)粒DNA的泳動(dòng)速度與其片段大小成正比，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker進(jìn)行對(duì)比，便可以獲得質(zhì)粒DNA分子量大小。利用向上毛細(xì)管法吸引DNA，將瓊脂糖凝膠上的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，通過(guò)與標(biāo)記DNA探針雜交、顯色，從而明確質(zhì)粒上是否攜帶目的DNA片段及判斷質(zhì)粒大小。5試劑與耗材5.11mol/LTris-HCl，pH8.0（按照附錄A.1配制）5.210mol/LNaOH（按照附錄A.2配制）5.30.5mol/LEDTA，pH8.0（按照附錄A.3配制）5.410×TBE，pH8.3（按照附錄A.4配制）5.5溴化乙錠（EB）染色液（按照附錄配制A.5）5.620mg/mL蛋白K儲(chǔ)存液（按照附錄A.6配制）5.7TE緩沖液，pH8.0（按照附錄A.7配制）5.8CLB，pH8.0（按照附錄A.8配制）5.9S1洗液，pH7.6（按照附錄A.9配制）5.10EcBuffer初始液，pH7.6（按照附錄A.10配制）5.11EcBuffer工作液（按照附錄A.11配制）5.12洗滌緩沖液（按照附錄A.12配制）5.13馬來(lái)酸緩沖液（按照附錄A.13配制）5.14檢測(cè)緩沖液（按照附錄A.14配制）5.15TE緩沖液（按照附錄A.15配制）5.1620×SSC（按照附錄A.16配制）5.170.2MEDTA（按照附錄A.17配制）5.18脫嘌呤液（按照附錄A.18配制）5.19變性液（按照附錄A.19配制）5.20中和緩沖液（按照附錄A.20配制）5.2110%SDS（按照附錄A.21配制）5.22洗液1（按照附錄A.22配制）5.23洗液2（按照附錄A.23配制）5.24阻斷液（按照附錄A.24配制）5.25抗體液（按照附錄A.25配制）5.26底物顯色液（按照附錄A.26配制）5.27DIGEasy雜交工作液（按照附錄A.27配制）5.28BHI瓊脂BrainHeartInfusionAgar（按照附錄A.28配制）5.29蛋白酶K5.30溶菌酶5.31RNA酶5.32XbaI酶5.33S1核酸內(nèi)切酶5.34細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒5.35離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒5.362×PhantaMaxMasterMix(DyePlus)5.37Southernblot雜交試劑盒(DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI)5.38LONZASeaKemGoldAgarose（SKG）5.39苯甲基磺酰氟（PMSF）5.40尼龍膜N+（0.45μm）5.413MM濾紙5.42美羅培南（純度≥98%）5.43接種環(huán)（10μL）5.44雜交管6儀器與設(shè)備6.1恒溫培養(yǎng)箱6.2振蕩培養(yǎng)箱6.3超凈工作臺(tái)6.4細(xì)菌濁度儀6.5水浴搖床6.6水浴鍋6.7pH酸度計(jì)6.8高壓滅菌鍋6.9微量可調(diào)移液器（2.5-1000μL）6.10脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀6.11雜交爐6.12凝膠成像系統(tǒng)6.13PCR擴(kuò)增儀6.14電子天平（精度0.1g）6.15渦旋振蕩器6.16高速離心機(jī)6.17紫外交聯(lián)儀7配制步驟7.1膠塊制備7.1.1含0.5μg/mL或1μg/mL美羅培南BHI瓊脂平板復(fù)蘇目的奇異變形桿菌，培養(yǎng)約16-18h，用接種環(huán)取適量加入1mLTE緩沖液中，12,000r/min離心8min，棄上清。7.1.21mLS1洗液重懸細(xì)菌，渦旋，12,000r/min離心8min，棄上清。7.1.3500μLEcBuffer工作液重懸菌體，細(xì)菌濁度儀調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞岫?.5-4.0，吸取200μL至1.5mLEP管。7.1.4EcBuffer工作液溶解SKG（2%99℃水浴加熱溶解至透亮放入60℃水浴鍋待用7.1.5200μLEcBuffer工作液重懸菌體中加入RNA酶（終濃度達(dá)到20μg/mL）和溶菌酶（終濃度達(dá)到1mg/mL）混勻，加入等體積SKG，混勻后加入模具，4℃冷凝10min。7.1.6冷凝膠塊加入1mLEcBuffer工作液，加入RNA酶（終濃度達(dá)到20μg/mL）和溶菌酶（終濃度達(dá)到1mg/mL37℃水浴1h。7.1.7膠塊轉(zhuǎn)移到1mLCLB裂解液中，50℃水浴2-3h或過(guò)夜。7.1.8待膠塊透亮后，取出膠塊放置在1mLTE緩沖液含1mMPMSF溶液中，37℃,150r/min，2h后倒出溶液重復(fù)一次。7.1.9膠塊放入1mLTE緩沖液37℃水浴，1h后倒出液體重復(fù)一次。7.1.10倒出液體把膠塊放入2mLEP管中，加適量TE緩沖液4℃保存?zhèn)溆谩?.2酶切7.2.1清洗膠塊：制備好的膠塊用1mL10mMTris37℃處理，15min后重復(fù)一次。7.2.2S1酶處理酶切：樣品菌株采用200μL酶切體系，37℃水浴50min，隨后棄去管內(nèi)液體，加1mLTE緩沖液置于冰上10min，終止酶切；使用沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812作為對(duì)照菌株，采用200μL酶切體系，首先37℃水浴預(yù)酶切10-15min，隨后棄去管內(nèi)液體，在加X(jué)baI的酶切體系中酶切3.5h，奇異變形桿菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812酶切體系配制分別見(jiàn)表1和表2。表1奇異變形桿菌酶切體系配制體系成分加入量ddH2O10×S1Buffer20S1酶（180U/μL）20總體積200表2標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812酶切體系配制試劑預(yù)酶切酶切ddH2O10×MBufferBSAXbaI總體積2020N200202042007.3制備電泳膠塊7.3.1清洗模具：蒸餾水清洗模具和梳子，再次用酒精清洗，晾干備用。7.3.2組裝模具：將擋板及梳子放置正確，旋緊旋鈕，計(jì)劃小膠塊放置順序，膠塊一分為二，對(duì)應(yīng)放置相同小膠塊，第一道、第八道和最后一道放置標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812。7.3.3放置小膠塊于梳子：用挖耳勺或者小刀片輕輕取已制備好的小膠塊的1/2-1/3大小，平整放至梳子齒上，用濾紙把膠塊周圍的液體吸干，調(diào)整位置水平，靜置10min，垂直豎起梳子插入膠槽。7.3.4融合膠塊：將熔化的1%SKG慢慢注入膠托內(nèi)（0.5×TBE制備110mL，預(yù)留補(bǔ)膠孔用SKG，60℃水浴備用槍頭去除氣泡，室溫冷卻凝固至膠塊顏色變白（30min左右）。7.3.5封閉膠孔：待膠塊凝固后，慢慢去除梳子，用溶化的1%SKG封閉加樣孔。7.4電泳液制備及機(jī)器參數(shù)設(shè)置7.4.1配液：制備2.5L0.5×TBE緩沖液，10×TBE稀釋20倍，冰中冷卻備用。7.4.2調(diào)水平：調(diào)整電泳槽旋鈕。7.4.3開(kāi)啟儀器：開(kāi)機(jī)順序?yàn)橹鳈C(jī)-泵-冷凝機(jī)，倒入2.0L電泳液，調(diào)整循環(huán)泵流速70，7.4.4電泳參數(shù)設(shè)置：起始電流一般在120-145mA間（控制在120-130最佳若出現(xiàn)溢出范圍，通過(guò)加入TBE或蒸餾水調(diào)整，終止電流一般不大于160mA（控制在140-150最7.4.5電泳：1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE緩沖液，電泳溫度14℃,電泳電壓6v/cm，脈沖轉(zhuǎn)換時(shí)間2.16-63.8s，脈沖角度120°,電泳時(shí)間16.5h。7.4.6膠塊放置：電泳儀運(yùn)行穩(wěn)定且符合條件后，暫停運(yùn)行，緩慢放置膠塊；清理干凈碎膠塊，以免堵塞機(jī)器；安放正確后開(kāi)始運(yùn)行，結(jié)束后2L蒸餾水清洗電泳槽2次，排空液體。7.5膠塊染色與脫色7.5.1切膠：膠塊一分為二，左邊染色，右邊轉(zhuǎn)膜。7.5.2染色：取出膠，放在300mLEB溶液中靜置染色1h（EB溶液有害，全程佩戴橡7.5.3脫色：300mL蒸餾水中靜置脫色30min。7.5.4照膠：凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并保存。7.6轉(zhuǎn)膜7.6.1去嘌呤：凝膠右下角切一個(gè)缺口做標(biāo)記，將凝膠背面朝上加入50mL脫嘌呤液50r/min振蕩15min，棄去液體。7.6.2變性：加入50mL變性液50r/min振蕩30min，棄去液體。7.6.3中和：加入50mL中和緩沖液50r/min振蕩15min后棄去重復(fù)一次，棄去液體。7.6.4轉(zhuǎn)膜：裁剪帶正電荷尼龍膜1張，面積稍微大于膠塊，裁剪與尼龍膜相同大小3MM濾紙2張，使用20×SSC浸濕，搭建鹽橋，保持重物平衡，及時(shí)更換吸水紙以加快轉(zhuǎn)膜（17h以上）。除鹽橋以外，其他部分不接觸溶液，層與層之間無(wú)氣泡（搭建鹽橋使用3MM濾紙大小參考值為36cm×14cm、正電荷尼龍膜大小參考值為13.5cm×7.5cm）。7.6.5清洗：結(jié)束后尼龍膜正面朝上放入6×SSC中浸潤(rùn)5min（15mL20×SSC＋35mL超超純水去除膠碎片。7.6.6固定：風(fēng)干或?yàn)V紙吸干表面水分，紫外交聯(lián)(3J/3min)，若不馬上轉(zhuǎn)膜，置于密封袋中4℃保存。7.7雜交將膜用鑷子卷起放入雜交管中，有DNA面向內(nèi)與雜交液直接接觸，用另一個(gè)配平，預(yù)雜交2h。7.7.2變性探針：變性DIG探針，煮沸10min至DNA變性，迅速冰浴10min，探針制備和標(biāo)記見(jiàn)附錄B。7.7.3雜交：加入5μL變性探針到預(yù)熱雜交液中（3.5mL/100cm268℃預(yù)熱15min迅速混勻避免氣泡產(chǎn)生，倒出預(yù)雜交液，加入雜交液，放入雜交爐，43℃雜交約20h（雜交完后探針回收，倒回管內(nèi)，可重復(fù)使用3-4次，每次使用前新鮮處理，68℃變性10min）。7.7.4洗膜1：洗液1室溫震蕩洗滌，5min后棄去液體重復(fù)一次。7.7.5洗膜2：洗液2雜交爐中預(yù)熱68℃振蕩洗滌，15min后重復(fù)一次。7.8顯色7.8.125mLWashingBuffer洗膜min，棄去液體。7.8.240mL阻斷液100r/min誘導(dǎo)30min，棄去液體。7.8.325mL抗體液100r/min誘導(dǎo)30min，棄去液體。7.8.525mLWashingBuffer洗膜15min，棄去液體后重復(fù)一次。7.8.625mL檢測(cè)緩沖液平衡5min，棄去液體。7.8.7將膜放入5mL新鮮底物顯色液容器中避光靜置顯色，30min后觀察結(jié)果，無(wú)條帶過(guò)夜，清水脫色5min。附錄A（規(guī)范性）相關(guān)試劑的配制A.11mol/LTris-HCl，pH8.0157.6gTris-HCl溶于800mL超純水中，室溫調(diào)pH至8.0，加水至終體積1000mL，高壓滅菌。A.210mol/LNaOH20gNaOH小心溶于40mL超純水中，冷卻至室溫，加滅菌超純水至終體積50mL。A.30.5mol/LEDTA，pH8.037.22gNa2EDTA.2H2O溶于160mL超純水中，加10mL10mol/LNaOH調(diào)pH至8.0，加水至終體積200mL，分成數(shù)份，高壓滅菌。A.410×TBE，pH8.3108gTris-base(0.9mol/L)，55g硼酸(0.9mol/L)，加入40mL0.5mol/LpH8.0EDTA儲(chǔ)存液(0.02mol/L)，溶于1000mL滅菌的超純水中，高壓滅菌。A.5溴化乙錠(EB)染色液10mg/mLEB儲(chǔ)存液用超純水1:10,000稀釋，即100mL水中加10μL儲(chǔ)存液或500mL水中加50μLEB儲(chǔ)存液，稀釋液在丟棄前可染5-6塊膠。A.620mg/mL蛋白K儲(chǔ)存液100mgProteinaseK粉末溶于5mL滅菌超純水中，混勻后分裝在1.5mL離心管中，每管500μL，-20℃保存?zhèn)溆?。A.7TE緩沖液，pH8.0（10mMTris-HCl：1mMEDTA）A.8CLB，pH8.0（含有50mmol/LTris-HCl，50mmol/LEDTA，1%十二烷基肌氨酸鈉，用前加蛋白酶K至終濃度0.1mg/mL）25mL1mol/LTris-HCl，pH8.0，50mL0.5mol/LEDTA，pH8.0，50mL10%十二烷基肌氨酸鈉，滅菌超純水稀釋至500mL，每5mLCLB加25μL蛋白酶K儲(chǔ)存液(20mg/mL)，使終濃度為0.1mg/mL。A.9S1洗液，pH7.61MNaCl(29.2g)，10mMTris-HCl(0.79g)，室溫調(diào)pH至7.6，加水至終體積500mL，高壓滅菌。A.10EcBuffer初始液，pH7.61MNaCl(29.22g)，100mMEDTA(18.61g)，6mMTris-HCl(0.47g)，室溫調(diào)pH至7.6，加水至終體積500mL，高壓滅菌。A.11EcBuffer工作液EcBuffer初始液(100mL)，Brij58(0.5g)，十二烷基肌氨酸鈉(0.5g)，去氧膽酸鈉(0.2g)。注：可放置烘箱或70℃水浴加速溶解A.12洗滌緩沖液(500mL)0.1M馬來(lái)酸(5.804g)，0.15MNaCl(4.383g)，pH7.5(加10MNaOH約7mL)，高壓滅菌冷卻后加1.5mLTween20(0.3%v/v)。A.13馬來(lái)酸緩沖液(500mL)0.1M馬來(lái)酸(5.804g)，0.15MNaCl(4.383g)，pH7.5(加10MNaOH約7mL)，高壓滅菌。A.14檢測(cè)緩沖液(500mL)0.1MTris-HCl(7.882g)，0.1MNaCl(2.922g)，pH9.5，高壓滅菌。A.15TE緩沖液(500mL)10mMTris-HCl(0.7882g)，1mMEDTA(0.14612g)，pH8.0，高壓滅菌。A.1620×SSC(500mL)3MNaCl(87.66g)，0.3M檸檬酸鈉(44.115g)，pH7.0，(加10MNaOH約100μL)，高壓滅菌。A.170.2MEDTA(10mL)Na2EDTA.2H2O(0.58448g)，pH8.0，高壓滅菌。A.18脫嘌呤液(500mL)0.25MHCl(12.5mL濃HCl)，先加適量水，再將酸加入水中，以防揮發(fā)，無(wú)需高壓滅菌。A.19變性液(500mL)1.5MNaCl(43.83g)(NaCl完全溶解后再加NaOH)，0.5MNaOH(10g)，高壓滅菌。A.20中和緩沖液(500mL)1.5MNaCl(43.83g)，1MTris-HCl(78.82g)，pH7.4，高壓滅菌。A.2110%SDS將10gSDS小心加入裝有80mL滅菌超純水的容器中，35-45℃輕輕混勻溶解，定容至100mL，滅菌濾器過(guò)濾至滅菌瓶中。A.22洗液12×SSC+0.1%SDS，臨用前配制：配50mL時(shí)，5mL20×SSC，0.5mL10%SDS。A.23洗液20.5×SSC+0.1%SDS,臨用前配制：配50mL時(shí)，1.25mL20×SSC，0.5mL10%SDS。A.24阻斷液阻斷液，用馬來(lái)酸緩沖液補(bǔ)齊至40mL。A.25抗體液每次使用抗DIG-AP(管4)前先10,000r/min離心5min，阻斷液1:5000(150mμ/mL)稀釋：