犬貓細(xì)小病毒PCR檢測方法

1犬貓細(xì)小病毒PCR檢測方法本文件規(guī)定了PCR診斷技術(shù)，可以同時檢測犬細(xì)小病毒、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（又稱貓細(xì)小病毒）的通用PCR診斷技術(shù)。本文件適用于檢測犬貓細(xì)小病毒核酸，適用于臨床樣品中不同型犬細(xì)小病毒和貓細(xì)小病毒的快速檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19289實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語CPV：犬細(xì)小病毒（CanineParvovirus）；FPV：貓細(xì)小病毒（FelineParvovirus）；PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）;CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c:不同的犬細(xì)小病毒分型5主要儀器μl，0.5-10μl，1-100μl，1-1000μl）、組織研磨器、水平電泳儀、紫外觀察燈或凝膠成像儀。6試劑和材料試驗用水均為滅菌超純水，應(yīng)符合GB/T6682中一級水的要求、醫(yī)用棉簽、槍頭（10μl，200μl，1000μl）、1.5mlEP管、0.2mlPCR管、dNTP（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L，-20℃保存。）、PCR檢測引物序列及反應(yīng)液配方見附錄B。10%十二烷基硫酸鈉：配制參見附錄A.1、蛋白酶K貯備液：配制參見附錄A.2、5×TBE電泳緩沖液：配制參見附錄A.3。27實驗步驟7.1樣品的采集與處理7.1.1血清樣品采集懷疑細(xì)小病毒感染的犬貓，使用非抗凝管采集全血，詳細(xì)標(biāo)記，登記，室溫靜置30min~1h，放入離心機并配平，4000r/min，離心5min，用移液器取離心后的上層血清至做好標(biāo)記的EP管，保存?zhèn)溆谩?.1.2糞便或肛拭子樣品采集使用糞便盒收集發(fā)生腹瀉的犬貓新鮮糞便，或使用棉拭子肛門轉(zhuǎn)圈采集糞便樣品加適量PBS(pH7.0)或滅菌超純水,充分混勻后，10000r/min離心5min；取上層水加蓋，編號，保存?zhèn)溆谩?.2核酸DNA提取1）取樣品處理液465μl，加人25μl10%十二烷基硫酸鈉和10μl的20mg/mL蛋白酶K，56℃水浴搖床上放置2h；2）加入等量的飽和酚溶液500μl，振蕩混勻20s，12000g離心5min，取上清液；3）加入等量的酚：三氯甲烷：異戊醇(25：24：1)，振蕩混勻20s，12000r/min，離心5min，取上清液；4）再加入等量的三氯甲烷：異戊醇(24∶1)，振蕩混勻20s，12000r/min離心5min，取上清液；5）最后加入兩倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，12000r/min離心10min，棄上清；6）室溫于燥后，加人30μl滅菌雙蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃貯存?zhèn)溆谩?）另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提試劑盒進(jìn)行。7.3PCR檢測反應(yīng)體系見附錄B.2。按下述條件進(jìn)行擴增:96℃預(yù)變性5min、（96℃30s、52℃30s、72℃45s，重復(fù)此循環(huán)30次）72℃延伸10min。反應(yīng)完畢，取PCR反應(yīng)液進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。7.4結(jié)果判定若待檢樣品可擴增出大小為669bp的核酸片段（參考核酸序列見附錄C），則判定細(xì)小病毒核酸陽性；若待檢樣品未擴增出核酸片段，同時加入的陰性對照（即核酸模板用滅菌水替代）成立，則判定核酸檢測陰性。3（資料性）溶液配方A.110%十二烷基硫酸鈉(SDS)在45ml三蒸水溶解5g十二烷基硫酸鈉(電泳級)，加熱至60℃溶解，用鹽酸調(diào)pH值至7.8，加三蒸水定容至50ml。A.2蛋白酶K貯備液(20mg/mL)每升三蒸水中加人三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.21mg，乙二胺四乙酸(EDTA)1.86mg，十二烷基硫酸鈉(SDS)5g，用鹽酸調(diào)pH值至7.8。取該溶液按每毫升加入20mg蛋白酶K，充分溶解后分裝。A.35×TBE電泳緩沖液每升三蒸水中加入三羥甲基氨基甲烷(Tris)54.0g，乙二胺四乙酸(EDTA)2.9mg，硼酸27.5g，用5mol/L的鹽酸調(diào)pH值至8.0。4（資料性）引物序列、PCR反應(yīng)體系B.1引物序列B.1.1犬貓細(xì)小病毒核酸PCR檢測方法通用引物序列見表B.1。表B.1引物序列引物序列（5’-3’）犬貓細(xì)小病毒擴增片段（bp）上游下游GTAAGCTTCCAGGAGACTTTGTAAGCTTCGTCGTGTTC669B.2PCR反應(yīng)液配方B.2.1犬貓細(xì)小病毒核酸PCR反應(yīng)液配方見表B.2。表B.2PCR反應(yīng)液配方PCR反應(yīng)液組分反應(yīng)體系10×PCRBuffer(withMg2+)TaqDNAPolymerase（5U/μL）dNTP（2.5mMeach）上游引物（100mM）下游引物（100mM）待檢樣品DNA模板滅菌超純水（至終體積50μl）0.5μl4μl(終濃度0.2mMeach)0.2μl(終濃度0.2μM)0.2μl(終濃度0.2μM)2.0μl（推薦0.1~1μg）B.2.2注意事項通常引物終濃度為0.2μM時可以獲得良好的檢測效果，可根據(jù)情況在0.1~1μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴增效率不高時，可提高引物濃度，發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度。5（資料性）擴增核酸序列AAGCTTCCAGGAGACTTTGGTTTGGTTGATAAAGAAGAATGGCCTTTAATATGTGCATGGTTAGTTAAACATGGTTATGAATCAACCATGGCTAACTATACACATCATTGGGGAAAAGTACCAGAATGGGATGAAAACTGGGCGGAGCCTAAAATACAAGAAGGTATAAATTCACCAGGTTGCAAAGACTTAGAGACACAAGCGGCAAGCAATCCTCAGAGTCAAGACCAAGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGTAGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAACAATCAAACCAACTTGGCGTTACTCACAAAGACGTACAAGCGAGTCCGACGTGGTCCGAAATAGAGGCAGACCTGAGAGCCATCTTTACTTCTGAACAATTGGAAGAAGATTTTCGAGACGACTTGGATTAAGGTACGATGGCACCTCCGGCAAAGAGAGCCAGGAGAGGTAAGGGTGTGTTAGTAAAGTGG