食品中菌落總數(shù)的測(cè)定

說明】蛋糕具有松軟香甜，攜帶方便、食用簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此成為人們居家生活特別是旅途中不可或缺的一種美食，深受人們的喜愛。測(cè)定蛋糕中的菌落總數(shù)可以用來判定其被微生物污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映蛋糕在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著蛋糕產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，因此，測(cè)定蛋糕中的菌落總數(shù)具有重要意義。目前應(yīng)用于測(cè)定食品中菌落總數(shù)的方法有:紙片法、電阻抗法等。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)標(biāo)法(GB\T對(duì)獨(dú)立包裝小蛋糕中菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定。并與GB7099-2003糕點(diǎn)、面包衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的冷加工糕點(diǎn)中菌落總數(shù)＜10000(cfu/g)的數(shù)據(jù)對(duì)比初步判斷樣品是否符合衛(wèi)生要求。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)并掌握測(cè)定蛋糕中菌落總數(shù)的方法及原理。2、 通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證冷藏對(duì)蛋糕的保鮮及抑菌作用。3、 了解菌落總數(shù)測(cè)定在食品衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)中的意義。二、 實(shí)驗(yàn)原理菌落總數(shù)即為食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下(如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等)培養(yǎng)后，所得每g(mL)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)用不同的營(yíng)養(yǎng)條件及其他生理?xiàng)l件(如溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等)去滿足其要求才能將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。但在實(shí)際工作中，一般都只用一種常用的方法。細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定，所得結(jié)果，只包括一群能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)并不表示樣品中實(shí)際存在的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱：36°C±1°C,30°C±1°C。冰箱：2C?5°C。恒溫水浴箱：46°C±1°C。天平：感量為g。均質(zhì)器。振蕩器。無菌吸管：1mL（具mL刻度）、10mL（具mL刻度）或微量移液器及吸頭。無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。放大鏡或/和菌落計(jì)數(shù)器。范記原味蛋糕，烘烤類糕點(diǎn)（冷加工），執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（GB/T20977）四、試劑和培養(yǎng)基及其制備平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基成分:胰蛋白胨g；酵母浸膏g；葡萄糖g；瓊脂g；蒸餾水1000mLpH±制法:將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121C高壓滅菌15min。磷酸鹽緩沖液成分:磷酸二氫鉀（KH2PO4） g；蒸餾水500mL;pH制法貯存液：稱取g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液mL，用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器中，121C高壓滅菌15min。無菌生理鹽水成分:氯化鈉g；蒸餾水1000mL制法稱取g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121°C高壓滅菌15min。五、實(shí)驗(yàn)步驟采樣在南寧市范記餅屋采購(gòu)生產(chǎn)日期為當(dāng)天的同批次的范記原味蛋糕，樣品為即食類預(yù)包裝食品,采樣時(shí)，取相同批次的最小零售原包裝，檢驗(yàn)前要保持包裝的完整，避免污染［3］。采集樣品的標(biāo)記應(yīng)對(duì)采集的樣品進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的記錄和標(biāo)記，采樣人應(yīng)清晰填寫采樣單（包括采樣人、采樣地點(diǎn)、時(shí)間、樣品名稱、來源、批號(hào)、數(shù)量、保存條件等信息）［3］。采集樣品的貯存和運(yùn)輸采樣后，應(yīng)將樣品在接近原有貯存溫度條件下盡快送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。運(yùn)輸時(shí)應(yīng)保持樣品完整。如不能及時(shí)運(yùn)送，應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存［3］。樣品處理實(shí)驗(yàn)室接到送檢樣品后應(yīng)認(rèn)真核對(duì)登記,確保樣品的相關(guān)信息完整并符合檢驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按要求盡快檢驗(yàn)。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)采取必要的措施保持樣品的原有狀態(tài)，防止樣品中目標(biāo)微生物因客觀條件的干擾而發(fā)生變化［3］。檢驗(yàn)員分組實(shí)驗(yàn)時(shí)檢驗(yàn)員分A、B、C三大組，每大組再分別分為三個(gè)小組，各組分工如下：A組測(cè)打開包裝后4C保存5h的樣品，A1、A2、A3三個(gè)小組分別測(cè)三個(gè)不同稀釋度樣品B組測(cè)打開包裝后常溫下存放5h的樣品，B1、B2、B3三個(gè)小組分別測(cè)三個(gè)不同稀釋度樣品C組做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。樣品的制備與稀釋試樣的前處理進(jìn)入無菌室后，先打開酒精燈，用酒精棉球擦試手及樣品外包裝，如為原包裝，用滅菌鑷子夾下包裝紙，采取糕點(diǎn)不同部位的樣品25g置入盛有225mL的滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，制成1：10的樣品勻液。用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。按操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)?3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。及時(shí)將15mL?20mL冷卻至46°C的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46°C±1°C恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。培養(yǎng)由于糕點(diǎn)樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落［2，］因此待瓊脂凝固后，在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL）,凝固后翻轉(zhuǎn)平板,36C±1C培養(yǎng)48h±2h。菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits,CFU）表示。選取菌落數(shù)在30CFU?300CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。六、結(jié)果與報(bào)告菌落總數(shù)的計(jì)算方法若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算N=2C/（n+O.ln）d 、12 （1）式中：N——樣品中菌落數(shù)；工C――平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1――第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2――第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d――稀釋因子（第一稀釋度）。若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU?300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時(shí)，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。表1稀釋度選擇及菌落數(shù)報(bào)告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)個(gè)/g或ml報(bào)告方式個(gè)/g或ml10-110-210-31多不可計(jì)16420—1640016000或X1042多不可計(jì)295463775038000或X1043多不可計(jì)271602710027000或X104

4多不可計(jì)多不可計(jì)313—31300310000或X105527115—270270或X1026000—<1X10<107多不可計(jì)30512—3050031000或X104菌落總數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告。表2小組結(jié)果記錄皿號(hào)菌落數(shù)稀釋度abc報(bào)告數(shù)1號(hào)皿2號(hào)皿空白對(duì)照皿1空白對(duì)照皿2七、注意事項(xiàng)在長(zhǎng)期的工作實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)糕點(diǎn)類樣品在進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)培養(yǎng)的時(shí)候，容易產(chǎn)生菌落的蔓延，鑒于這種情況，在樣品處理的時(shí)候應(yīng)注意充分均勻，稍作沉淀并吸上清液進(jìn)行稀釋培養(yǎng)，在培養(yǎng)的時(shí)候，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，進(jìn)行培養(yǎng)⑵。由于菌落總數(shù)產(chǎn)生誤差的最主要原因來原于檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)水平，檢驗(yàn)人員在選取平板進(jìn)行計(jì)數(shù)就顯得尤為重要，所以在選取平板進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)要盡量選取30—300CFU之間無蔓延、無片狀菌落生長(zhǎng)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，必要的時(shí)候要用放大鏡進(jìn)行觀測(cè)。每次實(shí)驗(yàn)須做空白對(duì)照，如果空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次所得結(jié)果無效⑵。由于檢驗(yàn)時(shí)樣品數(shù)量通常比較多，為了提高工作效率保持操作的連續(xù)、方便檢測(cè)人員往往先將所有樣品稀釋后再傾注平板，這樣個(gè)樣品由稀釋至傾注平板的時(shí)間通常要lh以上。王淑香等⑷通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品從稀釋到傾注平板的間隔時(shí)間越長(zhǎng)測(cè)出的菌落總數(shù)的結(jié)果越高。因此，樣品從稀釋到傾注平板的時(shí)間最好不要超過20min.在進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí),有一些樣品的殘?jiān)鼤?huì)在視覺上與菌落混淆?因此，在進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)該仔細(xì)分辨。菌落的形狀相對(duì)規(guī)則，比較有光澤度，更飽滿，而樣品的殘?jiān)容^不規(guī)則，沒有菌落的飽滿度和光澤度。另外，還可向培養(yǎng)基中添加一定濃度的TTC可以使菌落成紅色，便于觀測(cè)和計(jì)數(shù)，但TTC的濃度不宜過高，否則會(huì)抑制菌落的生長(zhǎng)[5]操作要快而準(zhǔn)，包括取樣、加樣、注入培養(yǎng)基等。樣品抽取時(shí)要無菌操作，并及時(shí)送檢。微生物檢驗(yàn)時(shí)以不超過兩人為度，檢測(cè)完要迅速進(jìn)行培養(yǎng)。八、檢驗(yàn)后樣品的處理檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，被檢樣品方能處理。檢出