第四章 現(xiàn)代生物技術(shù) 復(fù)習(xí)課件

第四章現(xiàn)代生物技術(shù)

復(fù)習(xí)課件第1節(jié)植物的組織培養(yǎng)1.說出植物組織培養(yǎng)的基本原理。2.說出植物細(xì)胞全能性的概念、基礎(chǔ)和條件。3.簡述植物組織培養(yǎng)技術(shù)的基本流程。4.記住影響植物組織培養(yǎng)的因素。5.說出生長素和細(xì)胞分裂素在植物組織培養(yǎng)中的作用。一二一、植物組織培養(yǎng)1.定義

植物組織培養(yǎng)就是在無菌和人工控制條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，最終誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織、叢芽或完整植株的技術(shù)。2.基本過程

制備MS固體培養(yǎng)基→外植體消毒→接種→培養(yǎng)→移栽→栽培3.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的意義

植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以保持優(yōu)良品種的遺傳特性，還可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖，因此植物組織培養(yǎng)技術(shù)也叫植物的微繁技術(shù)，或稱為快速繁殖技術(shù)。一二4.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

在農(nóng)業(yè)上可用于作物脫毒苗培育、制備人工種子和單倍體育種等；工業(yè)上可以進(jìn)行一些細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。思考：

馬鈴薯長期種植，產(chǎn)量降低而且易感染病毒，要想提高馬鈴薯的產(chǎn)量，培育無病毒的馬鈴薯應(yīng)該怎么做?

提示：研究發(fā)現(xiàn)，長期進(jìn)行無性繁殖的植物，只有根尖和莖尖中幾乎無病毒，因此可利用植物組織培養(yǎng)獲得無病毒的馬鈴薯植株。一二二、胡蘿卜的組織培養(yǎng)1.原理

植物體根、莖、葉的細(xì)胞一般都具有全能性，在一定的營養(yǎng)和激素條件下，可以脫分化形成愈傷組織。這些愈傷組織生長一段時間后，轉(zhuǎn)接到含有不同激素成分的培養(yǎng)基上，就可以誘導(dǎo)其再分化生成胚狀體或叢芽，進(jìn)而發(fā)育成完整的植株。植物組織培養(yǎng)的全過程反映了植物細(xì)胞的全能性，證明分化的植物細(xì)胞仍具有形成完整植株所需要的全部基因。一二2.方法步驟（1）制備培養(yǎng)基：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)并配制植物組織培養(yǎng)所需要的培養(yǎng)基，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。（2）滅菌：將上面的各培養(yǎng)基貼好標(biāo)簽并進(jìn)行滅菌。（3）組織培養(yǎng)：材料準(zhǔn)備→胡蘿卜切段消毒→切塊→接種→培養(yǎng)→轉(zhuǎn)接、分化培養(yǎng)。思考：

進(jìn)行細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)時，應(yīng)將離體的植物體經(jīng)組織培養(yǎng)至哪一階段?提示：應(yīng)培養(yǎng)到愈傷組織階段。1.細(xì)胞分化與植物細(xì)胞的全能性

多細(xì)胞生物體一般是由一個受精卵通過細(xì)胞的增殖和分化發(fā)育而成的。細(xì)胞分裂只能產(chǎn)生許多相同的細(xì)胞，只有經(jīng)過細(xì)胞分化才能形成不同的組織，進(jìn)一步形成各種器官、系統(tǒng)，從而完成生物的個體發(fā)育過程。當(dāng)細(xì)胞分化開始時，受遺傳因素和環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，不同細(xì)胞中的不同基因會在特定的時間、空間被激活，即基因的選擇性表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生了不同的組織，也就是在個體發(fā)育中相同細(xì)胞的后代，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生了穩(wěn)定性差異——細(xì)胞分化。一般來說，分化了的細(xì)胞將一直保持分化后的狀態(tài)，直到死亡。

由于體細(xì)胞大多是通過有絲分裂繁殖而來的，一般情況下已經(jīng)分化的細(xì)胞仍有一套和受精卵相同的染色體，含有與本物種相同的DNA分子。因此，已分化的細(xì)胞具有發(fā)育成完整新個體的潛能，即全能性。在合適的條件下，有些分化的細(xì)胞具有恢復(fù)分裂、重新分化發(fā)育成完整新個體的能力。植物細(xì)胞的全能性比較強(qiáng)，動物細(xì)胞的全能性受到了限制，特別是一些高度特化的動物細(xì)胞，但它的細(xì)胞核中仍有保持物種遺傳性的全部遺傳物質(zhì)，保持著全能性，例如已取得成功的克隆羊——多莉。2.愈傷組織

愈傷組織是通過細(xì)胞分裂形成的，排列疏松而無規(guī)則的，高度液泡化呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。它容易與根尖、莖尖的分生組織發(fā)生混淆。可以通過下表比較根尖分生組織和愈傷組織的異同。3.植物組織培養(yǎng)過程中污染的預(yù)防

污染就是指在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)容器內(nèi)滋生菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長發(fā)育，從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。植物組織培養(yǎng)不同于扦插、分根、葉插等常規(guī)無性繁殖，由于植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，所以對培養(yǎng)條件的要求較高，對無菌操作的要求非常嚴(yán)格。

污染有兩種可能：（1）由接種人員造成的，如未戴口罩，接種時說話，或手及器械消毒不嚴(yán)等。（2）由植物材料消毒不當(dāng)造成的。

可以通過以下措施做好預(yù)防。（1）防止外植體帶菌。①合理選擇外植體采集時期和采集部位。外植體采集以春、秋季為宜，優(yōu)先選擇地上部分作為外植體，采集時間一般選擇在晴天的下午，應(yīng)避免在陰雨天采集外植體，采集前應(yīng)噴殺蟲劑、殺菌劑或套塑料袋。②外植體消毒。③在室內(nèi)或無菌條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。（2）保證培養(yǎng)基及接種器具徹底滅菌。①培養(yǎng)基分裝時，注射器勿與瓶接觸，培養(yǎng)基勿粘瓶口；②檢查封口膜是否有破損；③扎瓶口要位置適當(dāng)、松緊適宜；④保證滅菌時間和高壓鍋內(nèi)溫度適當(dāng)；⑤接種工具使用前徹底滅菌；⑥工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品定期進(jìn)行濕熱滅菌。（3）操作人員嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程。如一定要規(guī)范著裝，操作過程中不說話等。（4）保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔。①污染瓶經(jīng)高壓滅菌后再清潔；②接種環(huán)境定期熏蒸消毒、紫外燈照射或用臭氧滅菌和消毒；③定期對培養(yǎng)室消毒。特別提醒：對外植體進(jìn)行表面消毒時，既要考慮到藥劑的消毒效果，又要考慮到植物的耐受力。不同藥劑、不同植物材料，甚至不同器官要區(qū)別對待。消毒用過的有毒藥品應(yīng)收集后統(tǒng)一交給有關(guān)專業(yè)部門處理，以免引起環(huán)境污染。

一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)材料被污染，特別是真菌性污染，一定不要打開培養(yǎng)瓶。應(yīng)先將所有被污染的培養(yǎng)瓶統(tǒng)一放在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌后，再打開培養(yǎng)瓶進(jìn)行清洗。題型一題型二題型三細(xì)胞的全能性【例題1】下列實(shí)例中能體現(xiàn)細(xì)胞全能性的是（

）①用培養(yǎng)基將單個胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)成了可育的植株②植物用種子進(jìn)行繁殖③用煙草組織中的單個細(xì)胞培育出了可育的完整植株A.①② B.①③ C.②③ D.①②③解析：①和③都屬已分化的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)形成可育的植株，體現(xiàn)了細(xì)胞的全能性。植物用種子繁殖后代，實(shí)際上是由一個受精卵，通過細(xì)胞的增殖和分化發(fā)育成新個體，是由未經(jīng)分化的細(xì)胞（受精卵）發(fā)育成新個體的過程，不能體現(xiàn)細(xì)胞的全能性。答案：B題型一題型二題型三植物細(xì)胞表達(dá)全能性的條件【例題2】植物細(xì)胞表現(xiàn)出全能性的必要條件是（

）A.給予適宜的營養(yǎng)和外界條件B.導(dǎo)入其他植物細(xì)胞的基因C.脫離母體后的具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞或組織，給予適宜的營養(yǎng)和外界條件D.將成熟篩管細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵細(xì)胞中解析：在生物體內(nèi)，細(xì)胞沒有表現(xiàn)出全能性，而是分化成為不同的組織、器官，這是基因在特定的時間和空間條件下選擇性表達(dá)的結(jié)果。當(dāng)植物細(xì)胞脫離母體后，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他適宜的外界條件的作用下，植物細(xì)胞就可以表現(xiàn)出全能性。答案：C題型一題型二題型三反思領(lǐng)悟：植物細(xì)胞表達(dá)全能性的條件：一是離體的組織或細(xì)胞；二是需要一定的激素、營養(yǎng)及其他適宜條件；三是具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞。題型一題型二題型三植物組織培養(yǎng)的過程及影響因素【例題3】草莓生產(chǎn)上傳統(tǒng)的繁殖方式易將所感染的病毒傳播給后代，導(dǎo)致產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差。運(yùn)用微繁技術(shù)可以培育出無病毒幼苗。草莓快速繁殖的基本過程如下：外植體

愈傷組織

芽、根

植株請回答下列問題。（1）微繁技術(shù)培育無病毒草莓時，一般選取

作為外植體，其依據(jù)是

。

（2）在過程①中，常用的MS培養(yǎng)基主要成分包括大量元素、微量元素和

，在配制好的培養(yǎng)基中，常常需要添加

，有利于外植體啟動細(xì)胞分裂形成愈傷組織。接種后2~5d，若發(fā)現(xiàn)外植體邊緣局部污染，原因可能是

。（3）在過程②中，愈傷組織在誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基中未形成根，但分化出了芽，其原因可能是

。

題型一題型二題型三解析：（1）培養(yǎng)無毒幼苗時常選取根尖或莖尖部位作為外植體，原因是該部位含病毒極少，甚至無病毒。（2）MS培養(yǎng)基的成分包括大量元素、微量元素和有機(jī)物，在配制好的培養(yǎng)基中，常需要添加生長素和細(xì)胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)劑。植物組織培養(yǎng)也應(yīng)注意無菌操作。（3）生長素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值低時，有利于芽的分化，比值高時，有利于根的分化。答案：（1）莖尖（或根尖）莖尖（或根尖）病毒極少，甚至無病毒（2）有機(jī)物植物生長調(diào)節(jié)劑外植體消毒不徹底（3）培養(yǎng)基中生長素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值偏低123451.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的理論基礎(chǔ)是（

）A.植物細(xì)胞的完整性

B.植物細(xì)胞的多樣性C.植物細(xì)胞的全能性

D.植物細(xì)胞雜交答案：C123452.下列有關(guān)植物組織培養(yǎng)的敘述，錯誤的是（

）A.植物組織培養(yǎng)的原理是細(xì)胞的全能性B.主要包括脫分化和再分化兩個階段C.外植體形成愈傷組織的過程需要陽光D.植物組織培養(yǎng)的過程中要求無菌操作答案：C解析：植物組織培養(yǎng)是指離體的植物細(xì)胞、組織或器官在無菌操作下經(jīng)脫分化和再分化形成完整植物體的過程，其原理是植物細(xì)胞的全能性。在脫分化形成愈傷組織的過程中，需要避光培養(yǎng)，因?yàn)樵跓o光條件下愈傷組織長得更快。123453.下列關(guān)于接種時應(yīng)注意的事項(xiàng)，全部正確的是（

）①接種室要消毒②無菌操作③接種時可以談話④外植體如莖段、莖尖可隨機(jī)放入培養(yǎng)基⑤接種時要防止交叉污染⑥接種完立刻蓋好瓶口A.①②③④ B.①②③④⑤⑥C.③④⑤⑥ D.①②⑤⑥答案：D解析：整個接種過程必須在無菌條件下進(jìn)行，為防止呼吸產(chǎn)生污染，操作過程應(yīng)禁止談話，并戴口罩；接種的外植體放入培養(yǎng)基時注意將形態(tài)學(xué)下端插入，而且分布均勻，以保證必要的營養(yǎng)和光照條件。123454.下列關(guān)于細(xì)胞分化的敘述，錯誤的是（

）A.細(xì)胞分化是一種持久性的變化，它發(fā)生在生物體的整個生命過程中B.細(xì)胞分化在胚胎時期達(dá)到最大限度C.隨著細(xì)胞分化的進(jìn)行，細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)種類會發(fā)生變化D.高度分化的動物細(xì)胞的細(xì)胞核保持著全能性答案：C解析：細(xì)胞分化不會使遺傳物質(zhì)種類發(fā)生變化，它的實(shí)質(zhì)是遺傳物質(zhì)在時間和空間上的選擇性表達(dá)。123455.辣椒素作為一種生物堿廣泛用于食品保健、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。辣椒素的獲得途徑如圖所示。（1）圖中①和②分別表示辣椒組織培養(yǎng)中細(xì)胞的

和

過程。（2）圖中培養(yǎng)外植體的培養(yǎng)基中常用的凝固劑是

。培養(yǎng)基中的生長素和細(xì)胞分裂素用量的比值

（填“高”或“低”）時，有利于芽的分化。對培養(yǎng)基徹底滅菌時，應(yīng)采取的滅菌方法是

。（3）圖中外植體的消毒所需酒精的體積分?jǐn)?shù)是

。用酶解法將愈傷組織分離成單細(xì)胞時，常用的酶是

和纖維素酶。

12345答案：（1）脫分化再分化（2）瓊脂低高壓蒸汽滅菌（3）70%果膠酶解析：（1）將外植體培養(yǎng)成愈傷組織，屬于脫分化過程，再生根、芽為再分化過程。（2）固體培養(yǎng)基的凝固劑多為瓊脂。生長素低于細(xì)胞分裂素時有利于芽的分化。高壓蒸汽滅菌可以殺死培養(yǎng)基中的一切細(xì)胞、芽孢、孢子。（3）體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精可以殺死外植體表面的微生物。植物細(xì)胞間質(zhì)為果膠和纖維素，可以用果膠酶和纖維素酶使愈傷組織分散為單個細(xì)胞。第2節(jié)蛋白質(zhì)的提取和分離1.簡述蛋白質(zhì)提取的基本過程和方法。2.記住電泳法等分離蛋白質(zhì)的基本原理。一二一、同工酶以及乳酸脫氫酶1.同工酶

指催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。2.乳酸脫氫酶（1）種類：一般含有5種同工酶。（2）特點(diǎn)：相對分子質(zhì)量相同，但所帶電荷不同，電泳結(jié)果應(yīng)該形成5個條帶。一二二、乳酸脫氫酶同工酶的提取和分離1.提取原理

乳酸脫氫酶同工酶可以與特定的底物進(jìn)行反應(yīng)，形成特殊的藍(lán)紫色產(chǎn)物。同工酶檢測必須依靠其具有催化活性的特點(diǎn)，從而使其和其他的可溶性蛋白質(zhì)區(qū)分開來。因此在提取此類蛋白質(zhì)時必須提供必要的緩沖系統(tǒng)和低溫環(huán)境以保持其生物活性。一二2.分離原理

蛋白質(zhì)在立體網(wǎng)狀的瓊脂糖凝膠中電泳時，其遷移率主要取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。因此，乳酸脫氫酶同工酶可以通過電泳分開。思考：

可否利用蛋白質(zhì)的提取與分離技術(shù)快速診斷早期癌變?

提示：可以。只需從早期患者的尿液、血液或細(xì)胞裂解液中提取少量蛋白質(zhì)樣品，采用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)，就可以更加快速、簡便、準(zhǔn)確地對細(xì)胞癌變作出診斷。3.實(shí)驗(yàn)步驟（1）提取過程：制備勻漿→獲取酶。（2）分離過程：制瓊脂糖凝膠電泳板→加樣、電泳→染色、觀察。1.蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)

將生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)提取出來并加以分離，就可以得到高純度的，甚至是單一種類的蛋白質(zhì)。

目前常用的蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)包括離心技術(shù)、層析技術(shù)和電泳技術(shù)等。其中，電泳技術(shù)最為快捷靈敏、簡便易行。

蛋白質(zhì)含有游離的氨基和羧基，是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下帶有電荷。作為帶電粒子，蛋白質(zhì)在電場中可以向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動，這就是電泳現(xiàn)象。蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越多，移動得越快；電荷數(shù)相同時，相對分子質(zhì)量越小，則移動越快。這就是利用電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)的原理。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳需要支持物，常用的是聚丙烯酰胺凝膠，由此而來的技術(shù)稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡稱PAGE。

不同蛋白質(zhì)的混合溶液，在經(jīng)過同一個電場電泳后，會在凝膠上形成不同的帶紋。每一種帶紋可能就是一種蛋白質(zhì)。如果要對每一個帶紋做進(jìn)一步的研究，只需將這些帶紋一個一個地剪下來，分別予以洗脫，然后對洗脫液中的蛋白質(zhì)做進(jìn)一步的分離。如果待測洗脫液不能再分離，則這個帶紋中很可能只含有一種單純蛋白質(zhì)。如果待測洗脫液還能再分離，則這個帶紋中含有多種蛋白質(zhì)，需要進(jìn)一步分離，直至提純。3.用凝膠色譜法分離血紅蛋白的過程

凝膠色譜法也稱分配色譜法，是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠實(shí)際上是一些由多糖類化合物構(gòu)成的微小多孔球體，在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時速度不同。相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。

凝膠色譜的操作：第一步要制作凝膠色譜柱。第二步要裝填凝膠色譜柱，因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液平衡好的凝膠的體積差別很大，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹噥y洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第三步是樣品的加入和洗脫。特別提醒：不是所有種類的蛋白質(zhì)的提取和分離都用同一種方法，蛋白質(zhì)的來源和性質(zhì)不同，分離方法差別很大。4.緩沖溶液

在一定范圍內(nèi)，能對抗少量外來強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或具有稍加稀釋不引起溶液pH明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一種或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得的，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH基本不變。在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH下進(jìn)行的，受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控。為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有與體內(nèi)過程相同的pH。題型一題型二電泳技術(shù)的原理與操作【例題1】下列關(guān)于電泳的說法，不正確的是（

）A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B.帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動C.蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少D.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子相對質(zhì)量的大小解析：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小和形狀等因素。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子相對質(zhì)量的大小。答案：C題型一題型二反思領(lǐng)悟：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)不同以及分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。題型一題型二蛋白質(zhì)的提取和分離【例題2】以下關(guān)于豬血紅蛋白提純的描述，不正確的是（

）A.洗滌紅細(xì)胞時，使用生理鹽水可防止紅細(xì)胞破裂B.豬成熟紅細(xì)胞中缺少細(xì)胞器和細(xì)胞核，提純時雜蛋白較少C.血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測D.在凝膠色譜法分離過程中，血紅蛋白比相對分子質(zhì)量較小的雜蛋白移動慢解析：凝膠色譜法分離時，大分子物質(zhì)由于分子直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布于凝膠顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快，相反，相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)向下移動速度較慢。答案：D123451.電泳過程中，什么樣的分子遷移速度最快?（

）A.纖維狀、大分子

B.纖維狀、小分子C.球狀、大分子

D.球狀、小分子答案：D解析：電泳就是利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同。一般來說，球狀分子比纖維狀分子移動快，小分子比大分子移動快。123452.下列說法不正確的是（

）A.在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液能夠抵制外界的酸和堿對溶液pH的影響，維持pH基本不變B.緩沖溶液通常由1~2種緩沖劑溶解于水中配制而成C.透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)D.乳酸脫氫酶一般含有4種同工酶答案：D解析：乳酸脫氫酶一般含有5種同工酶，其相對分子質(zhì)量相同，但所帶電荷不同。123453.蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是（

）A.根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離B.根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等，可通過電泳分離蛋白質(zhì)C.根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，可通過凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)D.根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過離心沉降法分離蛋白質(zhì)答案：A解析：蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，據(jù)此可利用半透膜除去樣品中相對分子質(zhì)量小的雜質(zhì)。123454.使用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的行進(jìn)過程，可表示為圖中（

）答案：B解析：本題考查對凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)原理的理解。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)留在凝膠顆粒外面，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部；相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)通過凝膠間隙先被洗脫，相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)進(jìn)入凝膠內(nèi)部而后被洗脫。123455.在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時，一定要加入緩沖溶液，其作用主要是（

）A.使酶的活力最高B.使蛋白質(zhì)的活力最高C.維持蛋白質(zhì)所帶的電荷D.使蛋白質(zhì)帶上電荷答案：C解析：蛋白質(zhì)具有兩性，在一定pH下，蛋白質(zhì)分子的某些基團(tuán)會帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。因此，加緩沖溶液的目的是維持蛋白質(zhì)所帶的電荷不發(fā)生改變。第3節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)1.記住PCR技術(shù)的原理。2.簡述PCR技術(shù)的基本操作。3.說出PCR技術(shù)的應(yīng)用。一二三一、DNA片段的擴(kuò)增1.概念PCR技術(shù)是體外酶促合成特定DNA片段的一種方法。2.擴(kuò)增條件

按照DNA復(fù)制所需條件，在體外酶促合成DNA時，必須具備待擴(kuò)增的目的DNA（DNA合成的模板）、合成DNA時所需的特異引物和原料——4種三磷酸脫氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、起酶促作用的耐熱TaqDNA聚合酶和作為反應(yīng)介質(zhì)的緩沖溶液。四一二三3.原理

根據(jù)DNA的理化特性，在高溫條件下，雙鏈DNA解旋變?yōu)閱捂淒NA（變性）；低溫條件下單鏈DNA又可恢復(fù)為雙鏈DNA（復(fù)性）；中溫條件下能進(jìn)行DNA合成，使DNA鏈延伸。由此，PCR反應(yīng)過程一般采取“高溫變性——低溫復(fù)性——中溫延伸”三個步驟，促使DNA進(jìn)行復(fù)制。以上述反應(yīng)作為一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，得到大量的目的DNA片段。四一二三四二、瓊脂糖凝膠電泳檢測

瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便的快速分離、純化和鑒定DNA的方法。瓊脂糖凝膠具有大小一致的剛性濾孔，帶有大量負(fù)電荷的DNA分子在外加電場的作用下可以通過這些濾孔向正極泳動。DNA片段在凝膠中的泳動速率主要取決于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子會在凝膠的一定位置形成DNA條帶。一二三四三、DNA片段的擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的方法步驟1.DNA片段的PCR擴(kuò)增（1）把PCR反應(yīng)體系的各種藥品加入冰浴的EP管中，混合均勻后低速離心。每管加入30μL無菌石蠟油。（2）將EP管放入PCR熱循環(huán)儀中，輸入并運(yùn)行反應(yīng)程序。2.擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測制作電泳膠板→加樣→電泳→觀察。一二三四四、PCR影響因素

在PCR實(shí)驗(yàn)中，需要擴(kuò)增的DNA片段的大小決定延伸的時間，片段較大，中溫延伸的時間就要相應(yīng)延長；引物的堿基數(shù)量和組成則決定著復(fù)性溫度的選擇，如果引物越短，A、T含量越多，PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度就越低，反之引物長度較長，G、C含量較高，則需要設(shè)計(jì)較高的復(fù)性溫度。TaqDNA聚合酶在PCR擴(kuò)增過程中也存在大約為1×10-5的出錯概率，而且隨著循環(huán)數(shù)的增加，其活性也逐漸降低。因此，PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)并非越多越好，一般控制在25~35個循環(huán)。一二三四思考：2014年埃博拉疫情在非洲蔓延，隨后生物科學(xué)研究工作者迅速研制出了埃博拉病毒檢測試劑盒，使得能夠快速診斷出埃博拉患者。那么，埃博拉病毒檢測試劑盒所需的大量埃博拉病毒基因是怎樣獲得的呢?

提示：采用PCR技術(shù)對埃博拉病毒的基因迅速擴(kuò)增產(chǎn)生的。1.PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制PCR反應(yīng)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以PCR反應(yīng)與DNA復(fù)制的原理相同，計(jì)算方法也大體相同。例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個這樣的片段。2.PCR的常見問題PCR實(shí)驗(yàn)很容易出現(xiàn)假陽性（檢測出非目的片段的擴(kuò)增，而未檢測出目的片段的擴(kuò)增）或假陰性（未檢測出任何片段的擴(kuò)增）的結(jié)果。PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成非目標(biāo)DNA片段的大量擴(kuò)增，因此模板DNA的污染是PCR出現(xiàn)假陽性結(jié)果的主要原因。此外，樣品中存在靶基因的類似序列也可能造成假陽性結(jié)果。為了避免因污染而造成的假陽性結(jié)果，PCR操作時要注意做到隔離操作區(qū)，分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性吸頭等。

出現(xiàn)假陰性結(jié)果的常見原因有TaqDNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)、PCR系統(tǒng)的建立欠妥當(dāng)及循環(huán)次數(shù)不夠，等等。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性的情況時，應(yīng)首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5~10次循環(huán)。為了防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，在選用TaqDNA聚合酶時，要注意用活力高、質(zhì)量好的酶。盡管TaqDNA聚合酶對模板純度的要求不高，但也不允許有機(jī)試劑的污染。所以，在提取DNA模板時，應(yīng)特別注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。PCR擴(kuò)增的先決條件以及特異性的高低，很大程度上取決于引物與靶DNA的互補(bǔ)情況，尤其需要保證引物的3'端與靶基因互補(bǔ)。PCR的原理及應(yīng)用【例題1】下列有關(guān)PCR的描述，不正確的是（

）A.是體外酶促合成特定DNA片段的一種技術(shù)B.引物一般采用人工合成的單鏈DNA片段C.PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加D.擴(kuò)增對象是氨基酸序列解析：PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，以四種三磷酸脫氧核苷酸為原料，在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3'端連接脫氧核苷酸，短時間迅速復(fù)制上百萬倍的DNA片段，其擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)方式增加。答案：D題型一題型二【例題2】標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是（

）A.94℃、40℃、72℃

B.72℃、40℃、94℃C.40℃、94℃、72℃

D.80℃、40℃、72℃解析：當(dāng)溫度上升到94~98℃時，雙鏈DNA變性成單鏈，稱之為變性；當(dāng)溫度迅速下降到40~60℃時，引物通過堿基互補(bǔ)配對與單鏈DNA結(jié)合；當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的四種脫氧核苷酸（A、T、C、G）在TaqDNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。答案：A題型一題型二題型一題型二解析：從土壤中分離微生物的一般流程是土壤取樣→制備培養(yǎng)基→分裝→制備土壤稀釋液→接種培養(yǎng)→觀察。該實(shí)驗(yàn)步驟沒有問題，但在前五步操作中都沒有進(jìn)行無菌操作，因而無法說明分解纖維素的微生物一定來自于土壤。答案：（1）取樣工具應(yīng)提前滅菌；不能用蒸餾水，應(yīng)用無菌水；該操作應(yīng)在火焰旁進(jìn)行。（3）培養(yǎng)基分裝并加濾紙條后應(yīng)滅菌。（4）在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁。（5）接種應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。題型一題型二PCR基本操作與產(chǎn)物測定【例題3】在PCR實(shí)驗(yàn)操作中，下列說法不正確的是（

）A.在擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測中需配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的瓊脂糖凝膠，制成電泳膠板B.離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止液體外溢C.在檢測時，需將膠板浸入溴化乙錠溶液染色5~10minD.離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果解析：在擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測中，需配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠，制作成電泳膠板。答案：A12341.有關(guān)PCR技術(shù)，下列敘述不正確的是（

）A.用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸B.在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時，DNA的復(fù)制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似C.PCR反應(yīng)只需一定的緩沖溶液和DNA模板以及四種三磷酸脫氧核苷酸D.PCR一般經(jīng)歷25~30個循環(huán)，每個循環(huán)分為變性、復(fù)性、延伸答案：C