細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告動(dòng)物細(xì)胞融合【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹竣绷私鈩?dòng)物細(xì)胞融合的常用方法。⒉學(xué)習(xí)化學(xué)融合的基本操作過程。⒊觀察動(dòng)物細(xì)胞融合過程中細(xì)胞的行為和變化。【實(shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞融合是指在自發(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并為雙核或者多核細(xì)胞的過程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合，包括病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融合和電激誘導(dǎo)融合。⒈病毒誘導(dǎo)融合仙臺(tái)病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導(dǎo)細(xì)胞的融合。這類病毒的被膜中含有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞融合，同時(shí)也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生融合。⒉化學(xué)誘導(dǎo)融合很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細(xì)胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過程中相接觸的細(xì)胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細(xì)胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合?；瘜W(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動(dòng)、植物細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學(xué)融合劑。⒊電激誘導(dǎo)融合包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)是先使細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊破細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒性、作用機(jī)制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。【實(shí)驗(yàn)用品】⒈材料雞血紅細(xì)胞。⒉試劑50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s細(xì)胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。⒊器材正置顯微鏡、離心機(jī)、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、注射器等?！緦?shí)驗(yàn)步驟】⒈雞血紅細(xì)胞的制備和保存用無菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再從雞翼下靜脈取血0.5~1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使總量為4~5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內(nèi)。⒉PEG誘導(dǎo)融合⑴取保存的雞血，離心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化鈉溶液配制成5%~10%的懸液。⑵稱取1gPEG放入試管內(nèi)，在沸水浴中融化后，加入1ml預(yù)熱的Hank’s溶液，混勻，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。⑶取上述雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，再加入5mlHank’s溶液混勻，然后以1000r/min離心5min，小心棄去上清液，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散。⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min內(nèi)滴加到雞紅細(xì)胞懸液中，邊加邊輕輕搖動(dòng)混勻。待PEG全部加入后靜置2~5min左右。⑸緩慢滴加6mlHank’s溶液以終止PEG的作用，混勻，靜置5min。⑹1000r/min離心3min，棄上清液后，取一滴融合后的細(xì)胞懸液滴片，加蓋玻片鏡檢。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】【分析與討論】⒈結(jié)果分析視野中有部分細(xì)胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，但是沒有觀察到細(xì)胞核。此外，視野中有些細(xì)胞發(fā)生重疊，是由于稀釋不足造成的。⒉注意事項(xiàng)⑴制備的雞血紅細(xì)胞懸液的濃度不宜過高，否則細(xì)胞容易聚集，融合效果受影響。⑵在離心之前，為了防止損壞儀器，應(yīng)配平離心機(jī)。具體方法為：把相對(duì)的兩個(gè)皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一個(gè)空的離心管，通過調(diào)節(jié)離心管中水的量來使天平達(dá)到平衡。⑶在制片之前，應(yīng)對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行充分稀釋，以免細(xì)胞發(fā)生重疊，影響觀察。⑷在制片之后，如雞血紅細(xì)胞懸液過多，則應(yīng)用吸水紙吸去，以免弄臟物鏡。⑸為了觀察清楚，應(yīng)把光線調(diào)暗，并改用小光圈。【相關(guān)鏈接】細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用⒈植物體細(xì)胞雜交植物體細(xì)胞雜交（plantsomatichybridization）,又稱原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，未脫壁的兩個(gè)細(xì)胞是很難融合的，植物細(xì)胞只有在脫去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細(xì)胞融合也稱為原生質(zhì)體融合。⒉單克隆抗體單克隆\o"醫(yī)學(xué)百科：抗體"抗體是由\o"醫(yī)學(xué)百科：淋巴細(xì)胞"淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合\o"醫(yī)學(xué)百科：抗原"抗原\o"醫(yī)學(xué)百科：分子"分子上某一單個(gè)\o"醫(yī)學(xué)百科：抗原決定簇"抗原決定簇的特異性抗體。\o"醫(yī)學(xué)百科：淋巴"淋巴\o"醫(yī)學(xué)百科：細(xì)胞"細(xì)胞雜交瘤是用人工\o"醫(yī)學(xué)百科：方法"方法使\o"醫(yī)學(xué)百科：骨髓瘤"骨髓瘤細(xì)胞（\o"醫(yī)學(xué)百科：純系"純系小鼠的\o"醫(yī)學(xué)百科：腹水"腹水瘤型\o"醫(yī)學(xué)百科：漿細(xì)胞"漿細(xì)胞）與已用抗原致敏并能分泌某種抗體的淋巴細(xì)胞（常用致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞，起\o"醫(yī)學(xué)百科：作用"作用的是其中的\o"醫(yī)學(xué)百科：B細(xì)胞"B細(xì)胞）融合而成的。用來使上述淋巴細(xì)胞致敏的抗原有人和動(dòng)物的\o"醫(yī)學(xué)百科：T細(xì)胞"T細(xì)胞、B細(xì)胞、\o"醫(yī)學(xué)百科：紅細(xì)胞"紅細(xì)胞、\o"醫(yī)學(xué)百科：腫瘤"腫瘤細(xì)胞、各種\o"醫(yī)學(xué)百科：微生物"微生物或其他抗原物質(zhì)等。這種融合細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞能大量、無限繁殖的特性，又具有B細(xì)胞能合成分泌特異性抗體的\o"醫(yī)學(xué)百科：能力"能力。由于一個(gè)B細(xì)胞克隆只針對(duì)一個(gè)抗原決定簇產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的抗體，所以一個(gè)B細(xì)胞與\o"醫(yī)學(xué)百科：骨髓"骨髓瘤\o"醫(yī)學(xué)百科：細(xì)胞融合"細(xì)胞融合而成的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞，也只產(chǎn)生某種單一的抗體。采用適當(dāng)方法把雜交瘤細(xì)胞\o"醫(yī)學(xué)百科：分離"分離出來，進(jìn)行單個(gè)\o"醫(yī)學(xué)百科：細(xì)胞培養(yǎng)"細(xì)胞培養(yǎng)，使之大量繁殖，則在該培養(yǎng)液中增殖而形成的細(xì)胞克隆，只產(chǎn)生完全均一的、單一特異性的抗體，即單克隆抗體。若把能產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤進(jìn)行大量培養(yǎng)，或注入原系動(dòng)物腹腔中，則雜交瘤仍以腹水型方式\o"醫(yī)學(xué)百科：生長"生長，在培養(yǎng)液或腹水中會(huì)含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術(shù)制備出來的單克隆抗體純度高、專一性強(qiáng)、\o"醫(yī)學(xué)百科：效價(jià)"效價(jià)高，使用時(shí)可免除不同細(xì)胞及微生\o"醫(yī)學(xué)百科：物種"物種或株間\o"醫(yī)學(xué)百科：血清"血清學(xué)上的交叉\o"醫(yī)學(xué)百科：反應(yīng)"反應(yīng)，大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外，在研究細(xì)胞表面標(biāo)志、提純可溶性抗原、進(jìn)一步研究抗體的\o"醫(yī)學(xué)百科：結(jié)構(gòu)"結(jié)構(gòu)和\o"醫(yī)學(xué)百科：功能"功能等方面都起著十分重要的作用。⒊細(xì)胞治療將自體細(xì)胞取出，經(jīng)培養(yǎng)3-5周后再移植（注射）到自體的病患部位，達(dá)到替代受損細(xì)胞修復(fù)之目的，細(xì)胞治療有長期的效果，細(xì)胞能釋放自身的愈合和再生能力，治療疾病（腫瘤；臟器；器官；疤痕；皺紋;皮膚化等）。⒋核移植核移植是將供體細(xì)胞核移入去核的卵