微生物實驗講稿

實驗一油鏡的使用和細菌的簡單染色法

一、目的要求

1.學習微生物涂片、染色的基本技術，掌握細菌的簡單染色方法。

2.初步認識細菌的形態(tài)特征。

3.掌握無菌操作技術。

二、基本原理

雖然可以用相差顯微鏡等直接觀察微生物的形態(tài)特征，但其應用有局限性

；用電子顯微鏡可以觀察到微生物的各種形態(tài)結構，但因其價格昂貴、設備條件要求高、操作也較復雜，應用上也受一定限制。所以，一般實驗室仍常用普通光學顯微鏡來進行微生物形態(tài)學特征的觀察。然而，微生物（尤其是細菌）細胞小而透明，當把菌懸液浮于水滴內，用光學顯微鏡觀察時，由于菌體和背景沒有顯著的明暗差，因而難以看清它們的形態(tài)，更不易識別其結構，所以，用不同光學顯微鏡觀察細菌時，往往要先將細菌進行染色，借助于顏色的反襯作用，可以更清楚地觀察到細菌的形狀及某些細胞結構。因此，為了研究微生物的形態(tài)特征和鑒別不同類群的微生物，微生物的染色及形態(tài)結構的觀察是微生物實驗中十分重要的基本技術。用于微生物染色的染料，是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基團和助色基團的有機化合物。發(fā)色基團賦予化合物的顏色特征，助色基團則給予化合物能夠成鹽的性質，僅含發(fā)色基團的苯化合物（稱色原）即使帶有顏色也不能作為染料，因為它不能電離，不能與酸或堿形成鹽，對微生物（或其他材料）沒有結合力，很容易被洗脫或機械方法除去。染料通常都是鹽，分酸性染料和堿性染料兩大類。在微生物染色中，堿性染料較常用，如常用的美藍（即亞甲藍）、結晶紫、堿性復紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于堿性染料。簡單染色法是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用堿性染料進行簡單染色，這是因為：在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電，荷酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷），因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有：美藍、結晶紫、堿性復紅等。當細菌分解糖類產酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。

三、器材

1.菌種枯草芽孢桿菌12-18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.染色劑呂氏堿性美藍染液（或草酸銨結晶紫染液），齊氏石炭酸復紅染液。

3.儀器或其他用具顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，生理鹽水等。

四、操作步驟

1.涂片取兩塊載玻片，各滴一小滴-生理鹽水（或蒸餾水）于玻片中央、用接種環(huán)以無菌操作分別從枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液（或液體培養(yǎng)物）涂片，可用接種環(huán)挑取2-3環(huán)直接涂于載玻片上。載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多；涂片要涂均勻，不宜過厚。

2.干燥

室溫自然干燥或酒精燈干燥。

3.固定涂面朝上，通過火焰2-3次。此操作過程稱熱固定，其目的是使細胞質凝固，以固定細胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。熱固定溫度不宜過高（以玻片背面不燙手為宜），否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)。

4.染色將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。呂氏堿性美藍染色1~2min；石炭酸復紅(或草酸銨結晶紫)染色約1min。

5.水洗倒去染液，用自來水沖洗，直至涂片上流下的水無色為止。水洗時，不要直接沖洗涂面，而應使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，以免涂片薄膜脫落。

6.干燥自然干燥，或用電吹風吹干，也可用吸水紙吸干。

7.鏡檢

涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。最后清理顯微鏡。

五、實驗報告

1.結果

根據觀察結果，繪出兩種細菌的形態(tài)圖。

2.思考題

(1)你認為制備細菌染色標本時，尤其應該注意哪些環(huán)節(jié)？

(2)為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察?

(3)如果你的涂片未經熱固定，將會出現什么問題?如果加熱溫度過高、時間太長，又會怎么樣呢？實驗二革蘭氏染色法、細菌的芽孢染色

一、目的要求

1.學習并初步掌握革蘭氏染色法。

2.了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。

二、基本原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChrstainGram氏創(chuàng)立的，而后一些學者在此基礎上作了某些改進。革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結晶紫進行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復染劑(如番紅)復染。經此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌

。

革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結構和組成不同決定的。實際上，當用結晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成、壁厚、類脂質含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫一碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫一碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。革蘭氏染色反應是細菌重要的鑒別特征，為保證染色結果的正確性，采用規(guī)范的染色方法是十分必要的。本實驗將介紹被普遍采用的Hucker氏改良的革蘭氏染色法。

三、器材

1.菌種：大腸桿菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，

2.染色劑：革蘭氏染色液。

3.儀器或其他用具：同實驗一

四、操作步驟

1.制片取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。

2.初染滴加結晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)染色1-2min，水洗。

3.媒染用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗

4.脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。革蘭氏染色結果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色時間一般約20-30s。5.復染用番紅液復染約2min，水洗。

6.鏡檢干燥后，用油鏡觀察。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。

7.混合涂片染色按上述方法，在同一載玻片上，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作混合涂片、染色、鏡檢進行比較。

五、實驗報告

1.結果列表簡述2株細菌的染色觀察結果(說明各菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應)。

2.思考題

（1）你認為哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結果的正確性?其中最關鍵的環(huán)節(jié)是什么?

（2）現有一株細菌寬度明顯大于大腸桿菌的粗壯桿菌，請你鑒定其革蘭氏染色反應。你怎樣運用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照菌株進行涂片染色，以證明你的染色結果正確性。

（3）你的染色結果是否正確?如果不正確，清說明原因。

（4）進行革蘭氏染色時，為什么特別強調菌齡不能太老，用老齡細菌染色會出現什么問題?

（5）革蘭氏染色時，初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復染之前，蘋蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應分別是什么顏色？

（6）你認為革蘭氏染色中，哪一個步驟可以省去而不影響最終結果?在什么情況下可以采用？

實驗三霉菌和酵母菌的形態(tài)觀察及酵母菌死活細胞的鑒別

一、目的要求觀察霉菌和酵母菌的形態(tài)觀察酵母菌出芽生殖方式，學習區(qū)分酵母菌死活細胞的實驗方法

二、基本原理霉菌可產生復什分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生孢子。霉菌菌絲體（尤其是繁殖菌絲）及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多（約3~10μm），常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。觀察霉菌的形態(tài)有多種方法，常用的有下列三種：直接制片觀察法：是將培養(yǎng)物置于乳酸石炭酸棉藍染色液中，制成霉菌制片鏡檢。用此染液制成的霉菌制片的特點是：細胞不變形；具有防腐作用，不易干燥，能保持較長時間；能防止孢子飛散；染液的藍色能增強反差。必要時，還可用樹膠封固，制成永久標本長期保存。載玻片培養(yǎng)觀察法：用無菌操作將培養(yǎng)基瓊脂薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養(yǎng)，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內沿蓋玻片橫向生長。培養(yǎng)一定時間后，將載玻片上的培養(yǎng)物置于顯微鏡下觀察。這種方法既可以保持霉菌自然生長狀態(tài)，還便于觀察不同發(fā)育期的培養(yǎng)物。玻璃培養(yǎng)觀察法：霉菌的玻璃紙培養(yǎng)觀察方法與放線菌的玻璃紙培養(yǎng)觀察方法相似。這種方法用于觀察不同生長階段霉菌的形態(tài)，也可獲得良好的效果。酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，其大小通常比常見細菌大幾倍甚至十幾倍。大多數酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過接合產生子囊孢子。本實驗通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態(tài)和出芽生殖方式。美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細胞是無色的、而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞

則呈藍色或淡藍色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。

三、器材

1.菌種：青霉、曲霉培養(yǎng)約4天的馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物、釀酒酵母培養(yǎng)約2d的麥芽汁(或YEPD)斜面培養(yǎng)物。

2.溶液或試劑：0.05％和0.1％呂氏堿性美藍染色液，革蘭氏染色用碘液。

3.儀器或其他用具：顯微鏡，載玻片，蓋玻片等。四、操作步驟1.霉菌形態(tài)觀察（1）直接制片觀察法在載玻片上加一滴水，用解剖針從霉菌菌落邊緣處挑取少量已產孢子的霉菌菌絲；先置于50％乙醇中浸一下以洗去脫落的孢子，再放在載玻片上的染液中，用解剖針小心地將菌絲分散開。蓋上蓋玻片，置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡觀察。

挑菌和制片時要細心，盡可能保持霉菌自然生長狀態(tài)；加蓋玻片時勿壓入氣泡，以免影響觀察。（2）載玻片培養(yǎng)觀察法①培養(yǎng)小室的滅菌：在平皿皿底鋪一張略小于皿底的圓濾紙片，再放一U形玻棒，其上放一潔凈載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋、包扎后于121℃②瓊脂塊的制作：取已滅菌的馬鈴薯瓊脂(或察氏瓊脂)培養(yǎng)基6~7ml注入另一滅菌平皿中，使之凝固成薄層。用解剖刀切成0.5~1cm2的瓊脂塊，并將其移至上述培養(yǎng)室中的載玻片上（每片放兩塊)。制作過程應注意無菌操作。③接種：用尖細的接種針挑取很少量的孢子接種于瓊脂塊的邊緣上，用無菌鑷子將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上。

接種量要少，盡可能將分散的孢子接種在瓊脂塊邊緣上，否則培養(yǎng)后菌絲過于稠密影響觀察。④培養(yǎng)：先在平皿的濾紙上加3～5ml滅菌的20％甘油（用于保持平皿內的濕度)，蓋上皿蓋，28℃⑤鏡檢：根據需要可以在不同的培養(yǎng)時間內取出載玻片置低倍鏡下觀察，必要時換高倍鏡。2、酵母菌形態(tài)觀察及酵母菌死活細胞的鑒別(1)在載玻片中央加一滴0.1％呂氏堿性美藍染色液，然后按無菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均勻。染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液會溢出或出現大量氣泡而影響觀察。

(2)用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。蓋玻片不宜平著放下，以免產生氣泡影響觀察。

(3)將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)和出芽情況，并根據顏色來區(qū)別死活細胞。

(4)染色約0.5h后再次進行觀察，注意死細胞數量是否增加。

(5)用0.05％呂氏堿性美藍染液重復上述操作。

五、實驗報告

1.結果

繪圖說明你所觀察到的霉菌和酵母菌的形態(tài)特征。

2.思考題（1）你主要根據哪些形態(tài)特征來區(qū)分上述四種霉菌？（2）你認為在顯微鏡下，細菌、放線菌、酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？（3）在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細菌？實驗四培養(yǎng)基的制備與滅菌第一部分：培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是入工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應含有水分、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。不同微生物對pH要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的(嗜堿細菌和嗜酸細菌例外)。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如果來不及滅菌，應暫存冰箱內，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基的類別如下：一、按成分的不同1.天然培養(yǎng)基

主要成分是復雜的天然有機物質，如馬鈴薯、玉米粉、豆餅粉、豆芽汁，牛肉膏，蛋白胨、血清等。這些復雜天然有機物質的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的數量也不恒定。這類培養(yǎng)基是實驗室和發(fā)酵工廠常用的培養(yǎng)基，例如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬鈴薯培養(yǎng)基，玉米粉、黃豆粉培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基等。2.合成培養(yǎng)基

用化學成分完全了解的純化合物藥品配制而成的培養(yǎng)基，因此也稱化學成分明確的培養(yǎng)基（chemicallydefinedmedium），如高氏I號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基等。一般用于研究微生物的形態(tài)，營養(yǎng)代謝、分類鑒定、菌種選育、遺傳分析等。3.半合成培養(yǎng)基

在以天然有機物作為微生物營養(yǎng)來源的同時，適當補充一些成分已知的化學藥品所配制的培養(yǎng)基叫半合成培養(yǎng)基。大多數微生物都能在此種培養(yǎng)基上生長，應用廣泛。例如常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，很多霉菌都生長良好。二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分1.固體培養(yǎng)基

在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑即為固體培養(yǎng)基。實驗用的凝固劑有瓊脂、瓊脂糖、明膠和硅膠，后者用于配制自養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基。對其他多數微生物來講，以瓊脂最為合適，一般加入1.5%~2.5%即可凝固成固體。此培養(yǎng)基可供微生物的分離、鑒定、活菌計數、菌種保藏等用。2.半固體培養(yǎng)基

在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑即可為半固體培養(yǎng)基。例如用瓊脂作凝固劑時只需加入0.2%~0.7%。此種培養(yǎng)基常用來觀察細菌運動的特征、菌種保存和噬菌體的分離純化及制備等。3.液體培養(yǎng)基

不含任何凝固劑，配好后成液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。廣泛用于微生物的培養(yǎng)，生理代謝和遺傳學的研究以及工業(yè)發(fā)酵等。三、按培養(yǎng)基的用途分1.基礎培養(yǎng)基

含有一般細菌生長繁殖需要的基本的營養(yǎng)物質。最常用的基礎培養(yǎng)基是天然培養(yǎng)基中的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分。2.營養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）

在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質，如血液、血清、動物（或植物）組織液，酵母浸膏或生長因子等。用以培養(yǎng)對營養(yǎng)要求苛刻的微生物，如培養(yǎng)百日咳桿菌需要含有血液的培養(yǎng)基。3.鑒別培養(yǎng)基

是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某種微生物在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，它所產生的某種代謝產物與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應，根據這一特征性反應可以將某種微生物與他種微生物區(qū)別開來。主要用于不同微生物的生理生化鑒定。如用來檢查細菌能否利用不同糖類產酸產氣的糖發(fā)酵培養(yǎng)基和能否產生硫化氫的醋酸鉛培養(yǎng)基等。4.選擇培養(yǎng)基

利用微生物對某種或某些化學物質的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質，抑制不需要的微生物生長，而利用所需分離的微生物生長，從而達到分離或鑒別某種微生物的目的。如分離真菌的馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基和既有選擇作用又有鑒別作用的遠藤氏（Endo）培養(yǎng)基等。微生物遺傳學研究中用來選擇營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基以及分子克隆技術中常用的加抗生素X-gal(5-溴-4-氧-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的培養(yǎng)基等均屬于選擇培養(yǎng)基。目前已有各種商品化的“干燥培養(yǎng)基”成品出售。這種培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧干燥法、真空干燥法、低溫干燥法或蒸發(fā)干燥法等將培養(yǎng)基內所含的水分去掉；或將培養(yǎng)基內的各種固形成分，經適當處理、充分混勻，便成干燥粉末而成。使用時只要按比例加入一定量的水，經溶解、分裝，高壓蒸氣滅菌，即可使用。這種培養(yǎng)基的優(yōu)點是配制省時，攜帶方便，使用簡易，質量穩(wěn)定。第二部分：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備一、目的要求1.明確培養(yǎng)基的配制原理。2.通過對基礎培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。二、基本原理

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，所以可供作微生物生長繁殖之用?；A培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下960C時溶化，實際應用時，一般在沸水浴中或下面墊以石棉網煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000ml，pH7.4-7.6三、器材1.溶液或試劑牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl。2.儀器或其他用具：試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸氣滅菌鍋，pH試紙(pH5.5-9.0)，棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。四、操作步驟1.稱量

按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。

蛋白胨很易吸濕，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯。2.溶化

在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱其溶解，或在磁力攪拌器上加熱溶解(圖Ⅴ-1)。將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積，如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補足所損失的水分。在制備用三角瓶盛固體培養(yǎng)基時，一般可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，然后按1.5%-2.0%的量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱溶化同步進行，節(jié)省時間。在瓊脂溶化過程中，應控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培養(yǎng)基中，影響細菌生長。3.調pH

在未調pH前，先用精密試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直至pH達7.6。反之，用1mol/LHCl進行調節(jié)。對于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調節(jié)可用酸度計進行（使用方法、可參考有關說明書）。

pH不要調過頭，以避免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時，若預先調好pH并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調整pH。4.過濾

趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利用某些實驗結果的觀察。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去（本實驗勿需過濾）。5.分裝

按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內或三角燒瓶內。（1）液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角燒瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準確。（2）固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一般為宜。（3）半固體分裝試管一般以試管高度1/3為宜，滅菌后垂直待凝。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。6.加塞

培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能（棉塞制作方法附本實驗后面）。7.包扎

加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。（有條件的實驗室，可用市售的鋁箔代替牛皮紙，省去用繩扎，而且效果好。)8.滅菌

將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，1210C，20min高壓蒸氣滅菌。9.擱置斜面

將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃10.無菌檢查

將滅菌培養(yǎng)基放入37℃附：棉塞的制作

棉塞的作用有二：一是防止雜菌污染，二是保證通氣良好。因此棉塞質量的優(yōu)劣對實驗的結果有很大的影響。正確的棉塞要求形狀，大小，松緊與試管口(或三角燒瓶口)完全適合，過緊則防礙空氣流通，操作不便；過松則達不到濾菌的目的。加塞時，應使棉塞長度的1/3在試管口外，2/3在試管口內。如圖V-4所示。做棉塞的棉花要選纖維較長的，一般不用脫脂棉做棉塞。因為它容易吸水變濕，造成污染，而且價格也貴。

此外，在微生物實驗和科研中，往往要用到通氣塞。所謂通氣塞，就是幾層紗布（一般8層）相互重疊而成，或是在兩層紗布間均勻鋪一層棉花而成。這種通氣塞通常加在裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶口上。經接種后，放在搖床上進行振蕩培養(yǎng)，以獲得良好的通氣促使菌體的生長或發(fā)酵，通氣塞的形狀如圖V-6。圖V-6五、實驗報告思考題1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應注意些什么問題？為什么？

第三部分：消毒與滅菌

消毒(disinfection)與滅菌(sterilization)兩者的意義有所不同。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體而言，滅菌則是指殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽孢和孢子。在微生物實驗中，需要進行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對所用器材、培養(yǎng)基和工作場所都要進行嚴格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、照射和使用化學藥品等方法。一、加熱法又分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。1.干熱滅菌

有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種，接種針和金屬用具如鑷子等，無菌操作時的試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的玻棒也可在醮有乙醇后進行灼燒滅菌。通常所說的于熱滅菌是在電烤箱內利用高溫干燥空氣（160℃-170℃)進行滅菌，此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用干熱滅菌。2.濕熱滅菌（1）高壓蒸氣滅菌法此法是將物品放在密閉的高壓蒸氣滅菌鍋內0.lMPa，121℃（2）常壓蒸氣滅菌法在不具備高壓蒸氣滅菌的情況下，常壓蒸氣滅菌是一種常用的滅菌方法。對于不易用高壓蒸氣滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等可采用常壓蒸氣滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動蒸氣滅菌器進行滅菌，也可用普通蒸籠進行滅菌。由于常壓，其溫度不超過1000C，僅能使大多數微生物被殺死，而芽孢細菌卻不能在短時間內殺死，因此可用間歇滅菌以殺死芽孢細菌，達到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養(yǎng)基放入滅菌器內，每天加熱100℃，30min，連續(xù)3d，第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物取出放室溫下18～24h，使其中的芽孢發(fā)育成營養(yǎng)體，第二天再加熱100（3）煮沸消毒法注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物學實驗室中煮沸消毒時間為10～15min，可以殺死細菌所有營養(yǎng)細胞和部分芽孢。如延長煮沸時間，并在水中加入1%碳酸氫鈉或2％～5％石炭酸，效果更好。入用注射器和手術器械均采用高壓蒸氣滅菌或干熱滅菌，或采用一次性無菌用品。（4）超高溫殺菌超高溫殺菌(ultrahightemperaturesterilization,簡稱UHTS)是指在溫度和時間標準分別為135-1500C和2-8s的條件下對牛乳或其他液態(tài)食品(如果汁及果汁飲料、豆乳、茶、酒及礦泉水等)進行處理的一種工藝，其最大優(yōu)點是既能殺死產品中的微生物，又能較好地保持食品品質與營養(yǎng)價值。超高溫殺菌工藝的應用，使乳制品及各種飲料等無需冷藏的理想變成了現實。從而打破了地域和季節(jié)的限制。

超高溫殺菌的基本原理是建立在食品品質及營養(yǎng)成分等，不遭受熱力破壞的溫度與微生物受熱死亡的溫度兩者之間差異很大這一規(guī)律之上的。從圖Ⅵ-1可以看出，在溫度上升不到135℃時，殺菌效應和牛乳褐變效應速率之比未發(fā)生顯著改變，但在135℃以上，該比率發(fā)生很大變化，例如在1400C時，殺菌效應比褐變效應速率增長2000倍，在150

超高溫殺菌是自80年代以來已在世界各國廣泛應用。我國自改革開放以來，超高溫殺菌也廣泛用于橘子汁，獼猴桃汁、荔枝汁、菊花茶、牛乳等生產。二、過濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，均會被熱破壞，因此采用過濾除菌的方法。應用最廣泛的過濾器有：(1)蔡氏(Seitz)過濾器，該濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個特制的金屬(銀或鋁)漏斗組成，分上、下兩節(jié)，過濾時，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液置于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張新濾板。根據其孔徑大小濾板分為三種型號：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來除去一般細菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過，使用時可根據需要選用。蔡氏過濾器的結構如圖Ⅵ-2。(2)微孔濾膜過濾器，這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。孔徑分0.025，0.05，0.10，0.20，0.22，0.30，0.45，0.60，0.65，0.80，1.00，2.00，3.00，5.00，7.00，8.00和10.00μm。過濾時，液體和小分子物質通過，細菌則被截留在濾膜上。實驗室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜不僅可以用于除菌，還可用來測定液體或氣體中的微生物。如水的微生物檢查。過濾除菌法應用十分廣泛，除實驗室用于某些溶液，試劑的除菌外，在微生物工業(yè)上所用的大量無菌空氣以及微生物工作使用的凈化工作臺，都是根據過濾除菌的原理設計的。三、輻射滅菌

紫外線波長在200~300nm，具有殺菌作用，其中以265~266nm殺菌力最強。此波長的紫外線易被細胞中核酸吸收，造成細胞損傷而殺菌，紫外線滅菌在微生物工作及生產實踐中應用較廣，無菌室或無菌接種箱空氣可用紫外線燈照射滅菌。此外，采用60Co-γ射線滅菌。也已廣泛用于不能進行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。γ射線滅菌的最大優(yōu)點是：穿透力強，可在厚包裝完好條件下滅菌。四、化學藥品滅菌

化學藥品消毒滅菌法是應用能抑制或殺死微生物的化學制劑進行消毒滅菌的方法。能破壞細菌代謝機能并有致死作用的化學藥劑為殺菌劑，如重金屑離子等，只是阻抑細菌代謝機能，使細菌不能增殖的化學藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數抗生素等。化學藥品對微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學藥品濃度的高低，處理微生物的時間長短，微生物的種類以及微生物所處的環(huán)境等有關。

微生物實驗室中常用的化學藥品有2％煤酚皂溶液(來蘇爾)，0.25％新潔爾滅，0.1％升汞，3%~5％的平醛溶液，75％乙醇溶液等。常用化學殺菌劑的應用范圍和濃度見表Ⅵ-1。表Ⅵ-1

消毒與滅菌不僅是從事微生物學和整個生命科學研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實用技術，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護、食品、生物制品等各方面均具有重要的應用價值。根據不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。本部分實驗主要介紹幾種常用的方法，包括干熱滅菌法，高壓蒸氣滅菌法，紫外線照射法，微孔濾膜法。關于常用的化學滅菌法，主要涉及藥物的種類和使用濃度，對微生物生長的抑制和滅活作用。

第四部分：高壓蒸氣滅菌一、目的要求1.了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應用范圍。2.學習高壓蒸氣滅菌的操作方法。二、基本原理

高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃

在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大，三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。1g水在100℃在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度?！闩囵B(yǎng)基用0.1MPa(相當于15Ib／in2或1.05kg／cm2)，121.5℃，15-30min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.06MPa(8Ib／in2或0.59kg／cm2)112.6℃滅菌15min，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3℃，20min滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內的培養(yǎng)基以0.1MPa，121.5

實驗中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式和手提式二種。其結構和工作原理相同，本實驗以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法。有關自控高壓蒸氣滅菌鍋(autoclave)的使用可參照廠家說明書。三、器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿（6套一包），手提式高壓蒸氣滅菌鍋等。四、操作步驟1.首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。切勿忘記加水，同時加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2.放回內層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3.加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊—致，勿使漏氣。4.用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.1MPa，121.5℃5.滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”

壓力一定要降到“0”6.將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37℃五、實驗報告1.結果檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。2.思考題(1)高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”(2)在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，怎樣杜絕一切不安全的因素?(3)滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義？(4)黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的胞子對熱的抗性哪個最強?為什么?實驗五顯微鏡直接計數法

一、目的要求

1．明確血細胞計數板計數的原理。

2．掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。

二、基本原理單細胞微生物個體生長時間較短，很快進入分裂繁殖階段，因此，個體生長難以測定，除非特殊目的，否則單個微生物細胞生長測定實際意義不大。微生物的生長與繁殖（個體數目增加）是交替進行的，它們的生長一般不是依據細胞的大小，而是以繁殖，即群體的生長作為微生物生長的指標。群體生長表現為細胞數目的增加或細胞物質的增加。測定細胞數目的方法有顯微鏡直接計數法（directmicroscopiccount）、平板菌落計數法（platecount）、光電比濁法（turbidityestimationbyspectrophotometer）、最大或然數法（mostprobablenumberMPN）以及膜過濾法（membranefiltration）等。測定細胞物質的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量。RNA和DNA的含量測定，代謝產物的測定等?？傊?，測定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點，工作中應根據具體要求加以選擇。本實驗主要介紹生產、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數法。顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計菌器），于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、Peteroff-Hauser計數器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總容積為0.02mm3，而且蓋玻片和載玻片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學檢查。顯微鏡直接計數法的優(yōu)點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結合活菌染色，微室培養(yǎng)（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數活菌體的目的。本實驗以血球計數板為例進行顯微鏡直接計數。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為1mm，則每一個大方格的面積為1mm3，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計數室的容積為0.1mm3（萬分之一毫升）計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成1ml菌液中的總菌數。設五個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果25個中方格的計數板，則：

1ml菌液中總菌數=A/5×25×104×B=50000A·B（個）

同理，如果是16個中方格的計數板，

1ml菌液中總菌數=A/5×16×104×B=32000A·B（個）

三、器材

1．菌種：釀酒酵母。

2．儀器或其他用具：血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。

四、操作步驟

1．菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當的菌懸液。

2．鏡檢計數室在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹

干后才能進行計數。

3．加樣品將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。取樣時先搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生。

4．顯微鏡計數加樣后靜止5min，然后將血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數。調節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計數室方格線，或只見豎線或只見橫線。在計數前若發(fā)現菌液太濃或太稀，需重新調節(jié)稀釋度后再計數。一般稀釋度要求每小格內約有5~10個菌體為宜。每個計數室選5個中格（可選4個角和中央的一個中格）中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣品的含菌量。

5．清洗血細胞計數板使用完畢后，將血細胞計數板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。

五、實驗報告

1．結果將結果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數；B表示菌液稀釋倍數。

各中格中菌數AB二室平均值菌數/ml12345第一室

第二室

2．思考題

（1）根據你的體會，說明用血細胞計數的誤差主要來自哪些方面？應如何盡量減少誤差、力求準確？

（2）某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計1~2種可行的檢測方法。實驗六微生物的大小測定

一、目的要求

1.學習并掌握用測微尺測定微生物大小的方法。

2.增強微生物細胞大小的感性認識。

二、基本原理

微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的測量工具-測微尺，包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長0.01mm（即10μm）。鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小，而是用于校正目鏡測微尺每格調相對長度。目鏡測微尺（是一塊可放入接目鏡內的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，有等分為50小格和100小格兩種。測量時，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數不同，目鏡測微尺每小格所代表的實際長度也不一樣。因此，用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺進行校正，以求出該顯微鏡在一定放大倍數的目鏡和物鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。然后根據微生物細胞相當于目鏡測微尺的格數，即可計算出細胞的實際大小。球菌用直徑來表示其大??；桿菌則用寬和長的范圍來表示，如釀酒酵母直徑約為4.5μm，枯草芽孢桿菌大小為0.7-0.8×2-3

μm。

三、器材

1.菌種：釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養(yǎng)物。

2.儀器或其他用具：目鏡測微尺，鏡臺測微尺，載玻片，蓋玻片，顯微鏡等。

四、操作步驟

1.裝目鏡測微尺

取出接目鏡，把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內

2.校正目鏡測微尺

(1)放鏡臺微尺：將鏡臺測微尺刻度面朝—上放在顯微鏡載物臺上。

(2)校正：先用低倍鏡觀察，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央，調節(jié)焦距，當清晰地看到鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內兩線完全重合，然后分別數出兩重合線之間鏡臺微尺和目鏡微尺所占的格數。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下，兩重合線之間兩尺分別所占的格數。觀察時光線不宜過強，否則難以找到鏡臺微尺的刻度；換高倍鏡和油鏡校正時，務必十分細心，防止接物鏡壓壞鏡臺微尺和損壞鏡頭。

(3)計算：由于已知鏡臺測微尺每格長10μm，根據下列公式即可分別計算出在不同放大倍數下，目鏡測微尺每格所代表的長度。

3.菌體大小測定目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上細菌染色制片。先用低倍鏡和高倍鏡找到標本后，換油鏡測定藤黃微球菌的直徑和大腸桿菌的寬度和長度。測定時，通過轉動目鏡微尺和移動載玻片，測出細菌直徑或寬和長所占目鏡測微尺的格數。最后將所測得的格數乘以目鏡測微尺(用油鏡時)每格所代表的長度，即為該菌的實際大小。通常測定對數生長期菌體來代表該菌的大??；可選擇有代表性的3~5個細胞進行測定；細菌的大小需用油鏡測定，以減少誤差。

4.測定完畢，取出目鏡測微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦拭干凈，放回盒內保存。

五、實驗報告

1.結果

（1）將目鏡測微尺校正結果填入下表：P48表

（2）將各菌測定結果填入下表：P48表

2.思考題為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正？實驗七

微生物的純種分離培養(yǎng)第一部分：微生物的分離與純化一、目的要求掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術。二、基本原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的方法有：簡易單細胞挑取法：它需要特制的顯微操縱器或其他顯微技術，因而其使用受到限制。簡易單孢子分離法是一種不需顯微單孢操作器，直接在普通顯微鏡下利用低倍鏡分離單孢子的方法。它采用很細的毛細管吸取較稀的萌發(fā)的孢子懸浮液滴在培養(yǎng)皿蓋的內壁上，在低倍鏡下逐個檢查微滴。將只含有一個萌發(fā)孢子的微滴放一小塊營養(yǎng)瓊脂片，使其發(fā)育成微菌落。再將微菌落轉移到培養(yǎng)基中，即可獲得僅由單個孢子發(fā)育而成的純培養(yǎng)。平板分離法：該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理包括兩方面：1.選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。2.微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用三種不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。三、器材1.菌種：米曲霉(Aspergillusoryzae)。2.培養(yǎng)基：淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號培養(yǎng)基)，牛蹂高蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。3.溶液或試劑：10％酚，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4％水瓊脂。4.儀器或其他用具無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細胞計數板等。四、操作步驟1.稀釋涂布干板法(1)倒平板將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55～60℃時，高氏I號瓊脂培養(yǎng)基中加入10％酚數滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液(終濃度為30μ倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地拔出，試管或瓶口保持對著火焰；然后用右手手撐邊緣或小指與無名指夾住管(瓶)塞(也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養(yǎng)基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中)。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。(2)制備土壤稀釋液：稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml(無菌操作)加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的土壤溶液。涂布：將上述每種培養(yǎng)基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.1ml對號放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒按所示，在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5～10min，使菌液吸附進培養(yǎng)基。平板涂布方法：將0.1ml菌懸液小心地滴在平板培養(yǎng)基表面中央位置(0.1ml的菌液要全部滴在培養(yǎng)基上，若吸移管尖端有剩余的，需將吸移管在培養(yǎng)基表面上輕輕地按一下便可)。右手拿無菌涂棒平放在乎板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之分布均勻，然后改變方向沿另一垂直線來回推動，平板內邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次。(4)培養(yǎng)：將高氏I號培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于280C溫室中培養(yǎng)3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2-3d。(5)挑菌落：將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和372.平板劃線分離法(1)倒平板按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培養(yǎng)基名稱、土樣編號和實驗日期。(2)劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-1的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使之形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：①用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉動培養(yǎng)皿約700角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。②將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。（3）挑菌落同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認為純化為止。3.簡易單孢子分離法（1）厚壁磨口毛細滴管的制備：截取一段玻璃管，在火焰上燒紅所要拉細的區(qū)域，然后用鑷子夾住其尖端，在火焰上拉成很細的毛細管。從尖端適當的部位割斷，用砂輪或砂紙仔細濕磨，使管口平整、光滑（毛細滴管要求達到點樣時出液均勻、快速，每微升孢子懸液約點50微滴，每滴的大小略小于低倍鏡的視野）。（2）分離小室的制備取無菌培養(yǎng)皿（D9cm)倒入約10ml4％水瓊脂作保濕劑。在皿蓋上用記號筆（最好用紅色）如圖所示畫方格。待凝后倒置于37℃（3）萌發(fā)孢子懸液的制備①孢子懸液的制備用接種環(huán)挑取米曲霉孢子數環(huán)接入盛有10ml查氏培養(yǎng)液及玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩5~10min，使孢子充分散開。②過濾用無菌漏斗（塞棉花）或自制的過裝置將上述充分散開的孢子液過濾，收集過濾液。③孢子萌發(fā)：將孢子過濾液用血球計數板測定孢子的濃度(此處可由教師準備)，再用查氏培養(yǎng)液調整孢子液至0.5~1.5x106個孢子／毫升后置280C培養(yǎng)8h。④點樣：用無菌自制的厚壁磨口毛細管吸取萌發(fā)孢子液少許，快速輕巧地點在培養(yǎng)皿的內壁的方格中，每微滴面積略小于顯微鏡低倍鏡視野，依次將每方格點上萌發(fā)孢子液，成為分離小室。最后將皿蓋小心快速翻過來，蓋在原來的平板上。⑤鏡檢：將點樣的分離小室平板放在顯微鏡鏡臺上，用低倍鏡逐個檢查皿蓋內壁上的微滴。如果觀察到某微滴內只有一個萌發(fā)孢子時用記號筆在皿蓋上作記號。⑥加薄片培養(yǎng)基：取少量查氏瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿先置450C預熱）中制成薄層平板，待其凝固后喲無菌小刀片將平板瓊脂切成若干小片（其面積應小于培養(yǎng)皿蓋上所畫小方格的面積），然后挑一小片放在作有記號的單孢子微滴上，⑦培養(yǎng)：將分離小室平板置28℃⑧轉種：用無菌微型小刀小心地挑取長有微菌落的瓊脂薄片移至新鮮的查氏培養(yǎng)基斜面或液體培養(yǎng)中，置28℃五、實驗結果1.結果（1）你所做的涂布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請分析其原因并重做。（2）在三種不同的平板上你分離得到哪些類群的微生物?簡述它們的菌落特征。2.思考題(1)如何確定平板上某單個菌落是否為純培養(yǎng)?請寫出實驗的主要步驟。(2)分離單孢子前為什么先使孢子萌發(fā)?(3)如果要分離得到極端嗜鹽細菌，在什么地方