細胞傳代和H·E染色盧文

傳代細胞培養(yǎng)以及染色生31盧文2003012377【實驗目的】掌握細胞傳代培養(yǎng)的原理和方法；掌握傳代細胞染色的方法?！緦嶒炘噭┖筒牧稀繉嶒炗迷噭㏄BS緩沖液（無Ca2+、Mg2+）：pH為7.2至7.4。培養(yǎng)液：DMEM+10%NBS（血清）+1%雙抗（100×，即10000U/mL的青霉素與鏈霉素混合劑）。pH約7.2。消化液：0.25%胰蛋白酶（trypsin）+1mmol-1EDTA混合液。Carnoy固定液（冰醋酸:無水乙醇＝1:3），蘇木精染液（蘇木精0.5g，無水乙醇10mL，硫酸鋁鉀25g，蒸餾水150mL，完全溶解后，混合均勻，加熱煮沸3－5min，加入蒸餾水至500mL，最后加入0.1g碘酸鈉），伊紅染液（0.5g伊紅B、100mL80%乙醇），0.5%鹽酸酒精溶液（0.5mL鹽酸、100mL70%乙醇），0.5%氨水。實驗材料小平皿、自動取液器、酒精燈、火柴?！緦嶒灢襟E】傳代培養(yǎng)（全部步驟均在超凈工作臺操作）步驟：鏡檢，觀察并記錄細胞狀態(tài)。吸棄培養(yǎng)基，加入1mLPBS溶液洗去殘余培養(yǎng)基。加200uL胰酶－EDTA溶液，37oC消化1－2min。加800uL含10％血清的DMEM培養(yǎng)基（終止消化、懸浮細胞）。按比例分盤，進行傳代培養(yǎng)。每盤細胞密度一致，細胞分散均勻。37oC、5％CO2培養(yǎng)。細胞染色（在實驗臺進行）步驟：顯微鏡下觀察細胞形態(tài)（4×10倍），繪圖。吸棄舊的培養(yǎng)液，用PBS蕩洗一次。用Carnoy固定液固定3min。吸棄固定液，用蒸餾水蕩洗一次。鐵礬蘇木精染色10min。用流動的自來水洗滌一次，加入0.5%的鹽酸酒精溶液分色（數(shù)秒），再用流動的自來水水洗一次。加入0.5%的氨水返藍（作用于蘇木精染劑），立即棄去。用流動的自來水洗一次，觀察細胞染色效果。如效果較好加入伊紅溶液染色，加入數(shù)秒后立即棄去。用蒸餾水洗滌次。鏡檢，繪出細胞形態(tài)圖并照相。細胞生長期觀察（在緩沖間進行）步驟：細胞培養(yǎng)的1天后，從培養(yǎng)箱取出平皿，顯微鏡下觀察細胞的數(shù)目、密度和形態(tài)情況。【實驗結果】觀察到的細胞貼壁和染色后圖像見手繪圖及圖1。蘇木精-伊紅染色之后，細胞核呈紫色，細胞質呈淡粉紅色。圖1：染色結果在細胞培養(yǎng)的過程中，開始培養(yǎng)的一天后觀察可見細胞已經(jīng)開始增殖，鏡下可見三至五個細胞團簇貼壁生長的景象。【實驗小結與討論】傳代細胞的特點：傳代細胞是指來自人或動物的腫瘤組織或者正常組織的細胞，其染色體組型發(fā)展為非整倍體或二倍體低于75%。這種非整倍體細胞在體外具有無限傳代的生命力。通常具有異種移植的能力和較廣泛的病毒敏感性。傳代細胞的特點是：具有恒定繁殖特性，少數(shù)細胞及有繁殖能力，在瓊脂內(nèi)能形成克?。蝗旧w組型為異倍體，大多數(shù)人源細胞染色體為60-70條左右；保留種屬特異性，但組織分化性和臟器特性均消失；具有致癌性。由于傳代細胞繁殖迅速，易獲得，易保存，為各種實驗所廣泛采用。影響HE染色效果的因素：因為HE染色是依靠靜電吸附原理進行染色，其影響因素如下：固定因素：固定劑對組織有一定媒染效果，它一方面可與蛋白質相結合，同時可能與燃料相結合，故能增強著色能力；同時固定劑能沉淀和凝固蛋白質、脂肪、糖等細胞內(nèi)成分，而這種沉淀及凝固關系能使細胞內(nèi)成分產(chǎn)生不同的折光率，造成光學上的差異，使得生活情況下原來看不清的結構變得清晰起來。所以，組織固定不良師造成染色不均、灰染的主要原因。在HE染色中，固定不足或過度都容易使片子發(fā)灰，細胞結構不清晰。固定后的水洗：在本次實驗中我們采用的固定劑是卡諾固定劑即冰醋酸和無水乙醇的混合液，因此在固定后必須充分水洗去固定液，否則殘留的冰醋酸時標本成酸性，將嚴重影響蘇木精對細胞核的染色。蘇木精的染色時間：據(jù)我的看法，以5min左右為宜。分色要適度：這是一個重要環(huán)節(jié)，若切片分化不足，細胞著色過深，使核質的分界不清楚，核不清晰；若分色過度，核太淡，反差不好。用0.5%的鹽酸酒精分色，我晃晃培養(yǎng)皿就迅速倒出。效果還好，稍微有點偏紅。反藍和伊紅染色：這兩步時間都不可太長。一般都是搖晃一下培養(yǎng)皿，使溶液和細胞充分接觸后就迅速倒出。關于蘇木精和伊紅的染色原理和實驗時使用的方法。伊紅B（eosinB）可以通過復染色與胞質的膠原蛋白作用從而使細胞質呈現(xiàn)顏色。蘇木精可以對細胞核特異性染色（Fulmer和Lillie法中主要是對細胞核蛋白染色）。蘇木精配方中的碘酸鈉主要起到使染劑盡快成熟的作用。由于伊紅的染色原理為復染，實驗中必須在用蘇木精染過一次才可進行。然而如果伊紅染色過深，其紅色會完全覆蓋掉之前用蘇木精染過的細胞核的藍色。因此可以在伊紅染過一次后再用蘇木精染一次，可以得到良好的效果。關于無菌操作的一些要點。本次實驗是本學期細胞生物學的最后一次實驗。本次實驗中我學習了日后會經(jīng)常使用的無菌操作的基本要點。由于它和“有菌操作”有著很大的不同，我總結了實驗中需要注意的幾個要點如下：無菌操作所用的器材和樣品一定不能暴露于超凈工作臺之外