SN 1465-2004西瓜細(xì)菌性果斑病菌檢疫鑒定方法

中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)西瓜細(xì)菌性果斑病菌檢疫鑒定方法2004-11-17發(fā)布2005-04-01實(shí)施I本標(biāo)準(zhǔn)由國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局負(fù)責(zé)起草，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)參加起草。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物檢疫中西瓜細(xì)菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli,簡稱A.a.c)的鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對瓜類植物種子中的西瓜細(xì)菌性果斑病菌的鑒定。原菌為西瓜細(xì)菌性果斑病菌[Acidovoraravenaesubsp.citrulli(Schaad,Sowell,Goth,ColwellandWebb1978)Willems,Goor,Thielemans,Gillis,KerstersandDeLey1992VP],該菌屬原核生物界(Procaryotae)、薄壁菌門(Gracilicutes)、暗細(xì)菌綱(Scotobacteria)、假單孢菌科(Pseudomonadaceae)、嗜性反應(yīng)等特征是該檢疫鑒定方法的依據(jù)。3儀器和用具3.1生物顯微鏡(具照相系統(tǒng))。3.3電子天平(感量1/10000)。3.4光照恒溫培養(yǎng)箱。3.5恒溫振蕩培養(yǎng)箱。3.6低溫冰箱。3.7高壓滅菌器。3.9恒溫水浴鍋(30℃~95℃)。3.10高速冷凍離心機(jī)(18000r/min以上)。2化鈉(NaCl)、氯化鉀(KC1)、10×PCR緩沖液(10mmol/LTris-HCl,10mmol/LKCl)、10×dNTP液5檢疫鑒定方法5.1種植觀察將待測的瓜類種子種植于溫室或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)的育苗缽(紙杯或塑料杯)中，每一育苗缽中種植2粒種子，每份種子樣品種植5000粒左右，最低不少于3000粒種子，生長環(huán)境溫度為25℃~35℃,相對濕度大于等于70%,種子出苗后15d內(nèi)觀察幼苗發(fā)病情況。如果種植期間有發(fā)病幼苗，且表現(xiàn)出西瓜細(xì)菌性果斑病苗期的典型癥狀(見附錄A),則采集可疑病株進(jìn)行分離培養(yǎng)及常規(guī)檢測，或直接用病葉提取核酸作PCR檢測。5.2分離培養(yǎng)5.2.1種子中病原菌的分離培養(yǎng)分別稱取待測瓜類種子樣品各100g,分裝于干凈紙袋中，做好標(biāo)記，供檢測用。無菌操作下，將供試樣品置于0.1%升汞溶液中表面消毒30s～80s(也可用含有效氯1%的次氯酸鈉溶液表面消毒2min~先制備好的金氏B平皿培養(yǎng)基上劃線，每一樣品做三個皿，28℃恒溫培養(yǎng)48h。A.a.c在金氏B培養(yǎng)用滅菌剪刀剪取病葉上的病斑，用含有效氯1%的次氯酸鈉溶液中表面消毒50s～60s,無菌水清洗三次，然后將其移至滅菌培養(yǎng)皿中，加5滴～10滴無菌水，用滅菌鑷子將病斑夾碎，使病組織液溶于無菌水中。用滅菌的移植環(huán)蘸取該液，在金氏B平皿培養(yǎng)基上劃線，每一處理做三個皿，28℃恒溫培養(yǎng)無菌操作下，在一個無菌培養(yǎng)皿中放一張滅菌濾紙，濾紙上加5滴現(xiàn)配的1%二甲基對苯二胺鹽酸鹽溶液，挑取生長24h的菌苔涂在濾紙上，若測試菌株的菌苔在20s內(nèi)變成紅色或紫色則為陽性反應(yīng)，5.4高溫培養(yǎng)將供試菌株的菌落在金氏B平皿培養(yǎng)基上劃線，每一處理做兩個皿，40℃恒溫培養(yǎng)48h,觀察細(xì)菌生長情況。A.a.c標(biāo)準(zhǔn)菌株在40℃下可以生長，而該菌的幾個近似種在40℃下不能生長。5.5半選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)將供試菌株分別在BFB-08、TWZ和EBB等半選擇性培養(yǎng)基所制備的平皿培養(yǎng)基上劃線，每一處理做三個皿，28℃恒溫培養(yǎng)48h。A.a.c標(biāo)準(zhǔn)菌株在BFB-08培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅褐色、凹陷、光滑的菌落，在TWZ培養(yǎng)基上產(chǎn)生深紅色、光滑、球形凸起的菌落，在EBB培養(yǎng)基上產(chǎn)生淡藍(lán)色、光滑菌落。各種半選擇性培養(yǎng)基配方見附錄B。5.6致病性測定將待測菌株在金氏B培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h左右，配成10?cfu/mL～10?cfu/mL的細(xì)菌懸浮液，用噴霧法接種在預(yù)先培育的、具2片～3片真葉的健康西瓜或甜瓜幼苗上，每一菌株接種3株～5株，用無菌水做對照。接種后用塑料袋罩住植株，使植株在25℃~35℃、相對濕度大于等于70%的條件下生長，第三天開始觀察發(fā)病情況，第十天結(jié)束，每天觀察一次。A.a.c標(biāo)準(zhǔn)菌株可形成附錄A所描述的癥狀。5.7PCR法檢測(可選擇項(xiàng)目)從分離培養(yǎng)的細(xì)菌菌株中提取核酸，或從表現(xiàn)典型癥狀的病葉中提取核酸，進(jìn)行PCR檢測和電泳分析。以提取的供試菌株或病葉的核酸為模板DNA,用A.a.c標(biāo)準(zhǔn)菌株的核酸作陽性對照，用非判定為檢出西瓜細(xì)菌性果斑病菌定為檢出西瓜細(xì)菌性果斑病菌保存樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后置于陰涼干燥、防蟲防鼠處妥善保存3個月。對檢出西瓜細(xì)菌性果斑病菌的樣品應(yīng)至少保存6個月，以備復(fù)檢、談判和仲裁，該類樣品保存期滿后，需經(jīng)滅菌后方可挑取菌落5環(huán)，置于無菌水中稀釋成細(xì)菌懸浮液。用滅菌注射器吸取菌懸液，注入滅菌的菌種保存管BacterialFruitBlotchofWatermelonA.2學(xué)名Acidovoraxavenaesubsp.citrulli(Schaad,Sowell,Goth,ColwellandWebb1978)Willems,Goor,Thielemans,Gillis,KerstersandDeLey西瓜細(xì)菌性果斑病菌主要通過帶菌種子作遠(yuǎn)距離傳播。在田間則通過雨水、農(nóng)事操作、昆蟲等5(規(guī)范性附錄)聚蛋白胨瓊脂粉硫酸鎂(MgSO?·7H?O)磷酸氫二鉀(K?HPO?)甘油蒸餾水B.2BFB08培養(yǎng)基小蘗堿(2mg/mL)將上述藥品先溶于蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4,然后振蕩加入以下藥品26g羧甲基纖維素和5g瓊脂粉。MgSO,·7H?O溴甲酚紫無水乙醇蒸餾水0.6mL(15mg/mL)亮甲酚藍(lán)R1mL(10mg/mL)6(資料性附錄)100mmol/LTris-Cl,pH8.0100mmol/LEDTA250mmol/LNaCl100μg/mL蛋白酶K1%(質(zhì)量濃度)CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)50mmol/LTris-Cl,pH8.010mmol/LEDTA,pH8.010mmol/LTris-Cl,pH8.01mmol/LEDTA,pH8.0滅菌后常溫保存，用時稀釋50倍。冰乙酸蒸餾水定溶至mL20%(質(zhì)量濃度)Ficoll4001.9%(質(zhì)量濃度)SDS0.1mol/LNa?EDTA混勻，65℃水浴中孵育30min。室溫12000r/min離心10min,取上清液700μL移至另一1.5mL離(24:1),顛倒混勻。室溫12000r/min離心10min,取上清液600μL移至另一1.5mL離心管中，加(1.2mol/L)溶解沉淀，室溫靜置5min,加入等體積的三氯甲烷-異戊醇(24:1),顛倒混勻。室溫引物名稱引物序列PCR產(chǎn)物大小WFB51正鏈：5’GACCAGCCACACTGGGAC3負(fù)鏈：5’CTGCCGTACTCCAGCGAT3’次序加樣體積10×PCR緩沖液2氯化鎂(25mmol/μL)3dNTP(10mmol/μL)4Tag酶(2IU/μL)5正鏈引物(10pmol/pL)