陳骨和燒骨DNA提取的法醫(yī)學鑒定探討

1.北京匯正卓越科技有限公司司法鑒定中心，北京102488；2.齊齊哈爾市公安局刑事技術支隊，黑龍江齊齊哈爾161000；3.北京中一諾達科技有限公司司法鑒定中心，北京100015；4.北京華大方瑞鑒定技術有限公司司法鑒定中心，北京101300；5.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭014040骨是由骨組織、骨膜和骨髓等構成的堅硬器官，在機體中主要起支持、運動和保護作用，骨中含有大量鈣、磷等礦物質(zhì)。骨組織是骨骼的主體結構，包括骨組織細胞和骨基質(zhì)。骨基質(zhì)是指鈣化的細胞外基質(zhì)，包括有機成分和無機成分。骨組織細胞包括成骨細胞、骨細胞、破骨細胞，細胞間質(zhì)主要是由膠原和羥基磷灰石構成。骨中30%是由骨細胞分泌的膠原，65%～75%則是骨骼的支撐結構羥基灰石。骨組織中骨細胞、成骨細胞和破骨細胞是骨骼DNA的主要來源。由于骨骼組織堅硬，具有良好的抗腐敗、侵蝕、灼燒等功能，是生物個體組織中降解緩慢、抗污染力強的結構，能夠較好保護生物個體的DNA，即使其他軟組織被完全腐敗、碳化，在骨骼組織中仍可提取DNA檢材。提供骨骼中DNA并進行生物信息檢測和比對研究，在當今考古、法庭科學領域中是一項重要的技術手段。在軟組織不具有提取DNA價值時，可以考慮在骨中提取DNA。法庭科學鑒定工作中，除了在腐敗尸體中提取骨DNA，還包括在陳骨和燒骨中提取DNA。然而同樣由于骨骼抗腐敗、侵蝕的原因，相較于其他組織，骨骼的酶解消化、DNA提取和純化難度也隨之增大。筆者通過在法醫(yī)物證學領域的工作和學習，分享了關于陳骨和燒骨DNA的提取、測序要點等檢驗鑒定內(nèi)容，以期為廣大鑒定同仁、法律界人士提供參考。一、陳骨與燒骨（一）陳骨對于陳骨的定義，目前尚無權威的解釋，主要是指年代久遠的骨骼，包括掩埋多年的尸體、古代尸體、木乃伊，甚至骨化石等。對于古代尸體等陳骨的研究，主要是考古界等為了進行種群溯源或族屬分類，如萬誠等人［1］通過對陳骨的DNA提取和測序，獲取了大量古人的遺傳信息，這些DNA信息為骨樣所屬時代和與之有關族屬的遷徙和發(fā)展，提供了豐富的研究資料。法庭科學鑒定工作中，對陳骨DNA的研究主要是為了進行個體識別。由于案發(fā)時間距離發(fā)現(xiàn)尸體的時間較遠，尸體因環(huán)境因素腐敗、白骨化，甚至骨骼被侵蝕、風化，難以辨識陳骨的個體信息，給案件偵破活動帶來困難。通過對陳骨中DNA的提取和檢驗，可以進行個體識別。當然，也可通過對陳骨中DNA的提取和檢驗，進行親緣關系鑒定，李成濤等人［2］曾報道了一起陳骨且骨骼已風化的案件，通過對陳骨與案件中可疑父母進行親緣關系鑒定，雖然檢出的基因位點較少，但仍推斷出了骨樣本身源者的性別，并推斷不排除骨樣與疑母存在親緣關系，為偵查提供了方向。（二）燒骨在法庭科學鑒定工作中，燒骨通常是指人體中骨骼與其他組織在火災、爆炸、焚尸等案件中，被焚燒后，殘留的燒焦尸骨或殘骨碎片。骨骼加熱到300℃以上時，開始因為灼燒而出現(xiàn)長軸方向裂隙，隨著溫度的升高，骨骼內(nèi)的有機物變性、喪失，骨骼的顏色開始由黃色向褐色、深褐色、黑色、灰白色、白色依次逐漸變化，骨骼的脆性也隨之增加。燒骨可以導致有機物變性、碳化，焚燒嚴重者可使有機物丟失、灰化，骨組織的DNA檢出率也隨骨骼的被焚燒程度變化，焚燒程度越高的，骨DNA的檢出率也隨之降低。二、骨中DNA的提取對骨DNA的提取，無論何種方法都應當避免污染，實驗室在收到骨檢材后，應按實驗室工作管理要求進行必要的登記和妥善保存。骨DNA提取前，首先應將骨樣洗凈晾干，而后進行紫外線照射，再以鋸、鉆、刮等方式取得骨屑或骨粉。與其他組織DNA的提取一樣，骨DNA的提取同樣遵循三個步驟，即第一，對材料進行細胞裂解，使其釋放DNA分子；第二，細胞裂解后，將DNA分子與其他細胞物質(zhì)分離；第三，將DNA提純，并制備成可以進行聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）擴增等應用形式的樣本。提取過程應防止樣本之間、樣本與外源物質(zhì)之間的污染。目前較為成熟的骨DNA提取方法有：苯酚-氯仿法、Chelex-100法、硅珠法、硅膠膜法等，對于燒骨更加微量DNA的提取，國內(nèi)學者還提出了改良苯酚-氯仿法、十六烷基三甲基溴化胺法［3］等。（一）苯酚-氯仿提取法苯酚-氯仿法是經(jīng)典的DNA提取方法，廣泛用于DNA測序工作中。在骨DNA提取時，采取碎骨、研磨方法取骨樣，通過乙二胺四乙酸鈉（EthyleneDiamineTetraaceticAcid，簡稱EDTA）脫鈣、十二烷基硫酸鈉（SodiumDodecylSulfate，簡稱SDS）去污、蛋白酶K（ProteinaseK，簡稱PK）消化，再通過離心分離DNA方式獲得樣液，而后使用苯酚（phenol）和氯仿（Trichloromethane，也稱三氯甲烷）進行萃取，最后獲得DNA。在此過程中，使用EDTA可以螯合鈣、鎂等金屬離子，極大減少組織被破壞，不影響DNA分子結構。（二）Chelex-100提取法Chelex-100是一種由苯乙烯和二乙烯苯共聚體組成的化學螯合樹脂，內(nèi)部含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子，具有非常明顯的螯合多價金屬離子作用。通過螯合鎂離子等，使核酸酶失去活性，保護DNA分子不被降解。在骨DNA提取時，與苯酚-氯仿提取法取得樣液過程相同，再通過Chelex-100提取DNA。提取過程中應始終在一個試管內(nèi)進行，可有效避免污染。但由于本法提取的DNA純度不高，所以筆者不建議運用Chelex-100法提取骨DNA。（三）硅珠提取法異硫氰酸胍（Guanidiniumthiocyanate，簡稱GuSCN）具有裂解消化細胞且抑制核酸酶活性的作用，硅珠法是通過碎骨、研磨、EDTA脫鈣、PK+GuSCN裂解消化骨中DNA，并利用硅珠在裂解介質(zhì)中對DNA的特異性吸附作用，將骨DNA進行提取。劉雅誠［4］等人研究認為，硅珠法相較于Chelex-100或苯酚-氯仿法，可以明顯提高骨DNA的檢出率。GuSCN屬于有毒物質(zhì)，特別是其在遇酸后可產(chǎn)生有毒氣體氰化氫（HCN），提取時應注意人員和環(huán)境的保護。（四）硅膠膜提取法硅膠膜法是通過挫骨、EDTA脫鈣、消解獲取含有骨DNA的樣液，再通過快速離心柱，將DNA結合到QIAamp硅膠膜上，并過濾掉其他污染物，再通過兩次洗滌，將二價陽離子和蛋白質(zhì)等去除，最高得到高純度的DNA。在取骨樣時，可以挫取骨粉的方法獲取，無需對骨樣進行研磨，減少提取流程，是筆者比較推薦使用的方法。［5］（五）改良苯酚-氯仿提取法徐國昌等人［6］通過對苯酚-氯仿法進行改良，并運用改良后方法進行實驗，研究后認為，改良方法雖然比常規(guī)方法多了3個步驟，且實驗時間也較常規(guī)方法耗時長，但DNA的產(chǎn)率明顯提高，是燒骨DNA提取工作中值得推廣的方法，可以有效維護DNA分子結構。在DNA提取時，使用EDTA可以極大減少組織破壞，不影響DNA分子結構；在氯仿、異戊醇的作用下，減少酚對DNA分子結構的破壞。對于DNA樣品純度不好的，應當進行純化處理，PCR反應物應當盡快進行電泳且體積在10ul為宜。當出現(xiàn)“影子帶”（StutterBand，又稱鬼影帶），讀取時應當進行嚴格鑒別。（六）十六烷基三甲基溴化銨提取法十六烷基三甲基溴化銨（SixteenAlkylThreeMethylBromide，CTAB）是一種陽離子去污劑，能溶解細胞膜，具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，可以用于從大量產(chǎn)生黏多糖的有機體中制備純化DNA。葉健等人［3］通過實驗，將燒骨研磨后加入CTAB緩沖液中，室溫下放置12～24h，而后加入PK，經(jīng)過水浴震蕩等流程使骨組織細胞釋放DNA，再通過離心獲取含有DNA的液體。通過磁珠純化DNA、PCR擴增后，焚燒度較輕燒骨可以檢驗完整清晰的DNA圖譜，焚燒度越重DNA的缺失位點越多。相較于傳統(tǒng)苯酚—氯仿提取法，CTAB法提取陳舊骨和燒骨的DNA更加穩(wěn)定、簡便。（七）其他其他還有一些新型的骨DNA提取方法，如美國的Steadman等人［7］研究的，利用熱離析作用協(xié)同PCR技術對燒骨DNA的提取，其實驗中使用了十種化學藥品，結果表明每一種處理方法都可以順利獲取DNA。三、結語法庭科學從業(yè)人員或司法鑒定人，在受理此類案件時，應對送檢骨樣進行初步審查，對陳骨的腐敗、降解程度和燒骨的燒灼程度進行肉眼綜合判斷，經(jīng)初步審查認為難以檢出或僅可部分檢出DNA序列的檢材，受理審查人員應在檢驗前向委托方進行告知。陳骨和燒骨的檢出率主要依靠取材和骨DNA提取過程，除了上述注意要點外，實驗時還應注意防止樣品污染。如，在吸加PCR試劑和模板時，吸樣要慢且盡量一次性完成，避免因多次抽吸導致的交叉污染或氣溶膠污染。取材料、碎骨、研磨、DNA提取等每一次操作過程要勤換手套，特別是進入不同區(qū)域、接觸不同物體都要更換手套。每一項操