初中生物實驗分離純化淀粉酶教案設計

生物材料中分離純化淀粉酶教案設計

一、目的和要求

L掌握鹽析法初步分離純化蛋白質(zhì)的原理和方法；

2.掌握透析脫鹽濃縮蛋白質(zhì)的原理和方法。

3.掌握膜分離原理和方法

二、基本原理

L蛋白質(zhì)的鹽析

蛋白質(zhì)是親水膠體，借水化膜和同性電荷(在ph值7.0的溶液中

一般蛋白質(zhì)帶負電荷)維持膠體的穩(wěn)定性。由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子

間電荷的極性基團有著靜電引力，當向蛋白質(zhì)溶液中加入少量堿金屬

或堿土金屬的中性鹽類［如(nh4)2so4、na2so4、nacl或mgso4等］時，

由于鹽類離子與水分子對蛋白質(zhì)分子上

的極性基團的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大，因此蛋白質(zhì)、

酶等在低鹽濃度下的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加，此時稱為鹽溶;

當鹽濃度不斷上升并達到一定濃度時，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和,

水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出，蛋白質(zhì)和酶的溶

解度又以不同程度下降并先后析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。

由鹽析所得的蛋白質(zhì)沉淀，經(jīng)過透析或用水稀釋以減低或除去鹽

后，能再溶解并恢復其分子原有結構及生物活性，因此由鹽析生成的

沉淀是可逆性沉淀。鹽析法就根據(jù)不同蛋白質(zhì)和酶在一定濃度的鹽溶

液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。鹽析法對于許多

非電解質(zhì)的分離純化都是適合的，也是蛋白質(zhì)和酶提純工作應用最早,

至今仍廣泛使用的方法。

2.透析脫鹽的原理

蛋白質(zhì)的分子很大，其顆粒在膠體顆粒范圍（直徑1?lOOnm）內(nèi)，

不能透過半透膜。選用孔徑合宜的半透膜，使小分子物質(zhì)能夠透過,

而蛋白質(zhì)顆粒不能透過，這樣就可使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開。把蛋

白質(zhì)溶液裝入透析袋中，袋的兩端用線扎緊，然后用蒸饋水或緩沖液

進行透析，這時鹽離子通過透析袋擴散到水或緩沖液中，蛋白質(zhì)分子

量大不能穿透析袋而保留在袋內(nèi)，通過不斷更換蒸鐳水或緩沖液，直

至袋內(nèi)鹽分透析完畢。這種方法可除去和蛋白質(zhì)混合的中性鹽及其他

小分子物質(zhì)，是常用來純化蛋白質(zhì)的方法。透析需要較長時間，常在

低溫下進行，并加入防腐劑避免蛋白質(zhì)和酶的變性或微生物的污染。

三、試驗材料

1.培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5g蛋白豚10gnacl5g可溶性淀粉2g葡萄糖

1.5g/1000mlh2o配100ml

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5g蛋白陳10gnacl5g可溶性淀粉2g/1000ml

2.酶活測定溶液

0.2mol/lph6.8pbs緩沖液葡萄糖標準液lmg/mldns試劑（3,5-二硝

基水楊酸試劑）

3.試劑

蛋白腺、牛肉膏、可溶性淀粉、（nh4）2so4、naoh>hcl、、na2hpo412h2o>

nah2Po4h2o、edta

4.儀器或其它用具

微量移液器、移液器槍頭、透析袋、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、紫外檢

測儀（分光光度計）、離心機、分析天平、ph計、量筒、250ml瓶、

分裝架、記號筆、紗布、酒精燈、滅菌鍋、干燥箱、恒溫水浴鍋等；

四、試驗路線

發(fā)酵培養(yǎng)好粗酶液制備-硫酸鏤鹽析玲透析脫鹽濃縮玲濃縮酶液

酶活測定

五、操作步驟

1.菌株發(fā)酵

將實驗一中純化的菌株接入種子培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)24h,2%的接種

量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃,180r/min,培養(yǎng)36h；

2.粗酶液的制備

發(fā)酵液在8000r/min離心20min,收集上清液即為粗酶液，測定酶

活方法參見實驗三dns測淀粉酶活力。

3.硫酸鏤鹽析

3.1鹽析條件的確定

40%、60%和80%

鹽析步驟

1）發(fā)酵液上清分裝至3支燒杯中，每個20ml；

2）加硫酸鏤至3支燒杯中，對照25℃硫酸錢飽和度配置表，使其

飽和度分別為40%、60%和80%。在加硫酸鏤時需緩慢的加入，同時

不斷的輕柔攪拌（否則局部濃度過高會使酶失活）使硫酸錢完全溶解;

3）室溫靜置2h,出現(xiàn)白色沉淀

4）離心，分別取沉淀用少量0.2mol/lph6.8pbs緩沖液回溶。

4.透析脫鹽濃縮

4.1透析膜前處理

透析袋的預處理方法：

1）將透析袋剪成合適的長度；

2）在一只250ml的玻璃燒杯中，加入200ml的透析袋處理液，微

波爐中預熱；

3）將透析袋裝入其中，電爐上煮沸l(wèi)Omin；

4）用蒸儲水徹底洗滌；

5）蒸儲水中煮lOmin；

6）冷卻后4℃存放，存放過程中透析袋應完全放入0.02mol/l磷酸

酸緩沖液（ph7.0）中

7用細線扎緊透析袋一端，注入清水檢驗不漏后加入不超過透析袋

體積1/2的須透析溶液。

4.2操作

1沉淀用少量0.2mol/lph6.8pbs緩沖液回溶，移入透析袋中，經(jīng)透

析膜袋在20倍量0.02mol/l磷酸緩沖液（ph7.0）中在室溫，36h透析

脫鹽（每過6h換一次透析液）.

2取各梯度脫鹽沉淀5ml8000r/min離心20min,取上清測酶活。（沉

淀為變性蛋白質(zhì)酶活很低。）

5.酶活力的測定

參照實驗三中的酶活測定。

實驗數(shù)據(jù)

粗酶液540nm0.2910.314

鹽析40%60%80%

1.2212.7081.456

七、實驗報告

1.實驗結果

（1）測定粗酶液酶活；

粗酶液540nm0.2910.314（取平均值）

酶活力9.705

（2）測定透析后酶液的酶活力

40%60%80%

540nm吸光度1.2212.7081.456

酶活力36.6381.2443.68

2.實驗結果分析

通過比較可知在硫酸錢飽和度為60%時分離純化淀粉酶酶活力最

高。經(jīng)鹽析，透析除鹽后酶活力大大提高純化后的酶活力約為粗酶活

力的4~9倍。

八、注意事項

(1)硫酸核飽和度計算及加入方式：在分段鹽析時，加鹽濃度一

般以飽和度表示，所需達到飽和度較高而溶液的體積又不再過分增大

時，可直接加固體硫酸筱，其加入量見附表。注意看清是25℃硫酸

錢飽和度表

(2)清洗透析袋內(nèi)外時，操作過程中應使用鑲子或戴手套；

(3)蛋白質(zhì)溶液用透析法去鹽時，正負離子透過半透膜的速度不

同。以硫酸錢為例，nh4+的透出較快.在透析過