miR-145-5p通過(guò)靶向MLK3調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及銀屑病皮膚炎癥反應(yīng)

miR-145-5p通過(guò)靶向MLK3調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及銀屑病皮膚炎癥反應(yīng)研究背景銀屑病是T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病,具有遺傳背景,其典型臨床表現(xiàn)為鱗屑性丘疹、斑塊。近年來(lái)銀屑病的免疫學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),Treg/Th17調(diào)控失衡導(dǎo)致的免疫微環(huán)境紊亂是其發(fā)病的主要原因,且與環(huán)境、感染及精神因素等密切相關(guān)。迄今,銀屑病發(fā)病的始動(dòng)誘因以及分子機(jī)制尚未完全明確。深入探討銀屑病發(fā)病的具體分子機(jī)制以及尋找與該病相關(guān)的分子靶標(biāo),對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要理論意義。微小核糖核酸microRNA-145-5p(miR-145-5p)在免疫相關(guān)性疾病中的調(diào)控作用受到越來(lái)越多的關(guān)注,但是其是否參與調(diào)控銀屑病的炎癥反應(yīng)過(guò)程尚不清楚。越來(lái)越多的研究證明microRNA(miRNA)異常表達(dá)參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展。MiR-145-5p作為miRNA家族中重要的一員,與多種免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis,RA)、慢性腎小球腎炎(Chronicglomerulonephritis,CGN)以及神經(jīng)炎癥等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),miR-145-5p可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)及核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)等信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖及多種炎癥因子的表達(dá),包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α以及CXCL16等,在免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而,miR-145-5p是否參與銀屑病的發(fā)病尚不明確。我們前期進(jìn)行miRNA芯片結(jié)果顯示miR-145-5p在銀屑病皮損組織中表達(dá)顯著下調(diào),提示在銀屑病中miR-145-5p表達(dá)水平降低可能參與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展。我們通過(guò)生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)出混合譜系激酶3(Mixed-LineageKinase3,MLK3)是miR-145-5p的潛在靶基因之一。MLK3首先在人類(lèi)胸腺組織中發(fā)現(xiàn),其廣泛表達(dá)于人體各組織中,是絲蘇氨酸蛋白激酶家族中的一個(gè)成員,包含激酶結(jié)構(gòu)域、中央亮氨酸拉鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域以及Src同源3結(jié)構(gòu)域。MLK3作為一種MAP3K(Mitogen-activatedproteinKinaseKinaseKinase)蛋白激酶,可以激活下游MAP2K3/4/6/7(Mitogen-activatedproteinKinaseKinase3/4/6/7,MAP2K3/4/6/7,MKK3/4/6/7)等蛋白分子,并參與調(diào)控MAPK及NF-κB等信號(hào)通路,影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及免疫反應(yīng)過(guò)程。MLK3在調(diào)控MAPK及NF-κκB信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用,參與對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控,與多種免疫相關(guān)性疾病的的發(fā)病密切相關(guān),然而其是否參與調(diào)控銀屑病皮膚炎癥反應(yīng)尚不明確。研究目的:1.明確miR-145-5p及MLK3在銀屑病皮損組織表達(dá)情況并驗(yàn)證miR-145-5p與MLK3間是否存在靶向調(diào)控關(guān)系;2.研究miR-145-5p及MLK3對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及炎癥因子分泌的影響及其分子機(jī)制;3.明確miR-145-5p對(duì)銀屑病表皮增生及皮膚炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及其作用機(jī)制。第一部分差異表達(dá)miRNAs的篩選和驗(yàn)證及miR-145-5p靶向調(diào)控MLK3的表達(dá)方法:(11)使用miRNA芯片ExiqonmiRCURYLNAmicroRNAarray,7thgeneration(miRBasev18,condensedProbe_IDversion,Exiqon,Vedbaek,Denmark)篩查銀屑病皮損及健康對(duì)照(n=4),檢測(cè)差異表達(dá)的miRNAs;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)(n=10)對(duì)miRNA芯片篩查出下調(diào)最顯著的8個(gè)miRNAs及既往研究報(bào)道的3個(gè)miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)以5.8SrRNA作為內(nèi)參,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△CT表示。(2)通過(guò)熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)銀屑病皮損組織中miR-145-5p的表達(dá)水平。(3)運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的方法(TargetScan,miRmap,miRandaandmiRTarbase)預(yù)測(cè)出MLK3可能為miR-145-5p靶向調(diào)控的基因,并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因(Luciferasereporterassay)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。(4)通過(guò)qRT-PCR、免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)銀屑病皮損區(qū)MLK3mRNA及蛋白的表達(dá)情況(n=10)。結(jié)果:(1)MiRNA芯片結(jié)果及驗(yàn)證:miRNA芯片篩查結(jié)果顯示,銀屑病皮損區(qū)差異表達(dá)的miRNAs(foldchange>2,P<0.05)共116條;通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證8個(gè)下調(diào)最顯著的miRNAs及3個(gè)既往報(bào)道的miRNAs,結(jié)果顯示miR-10b-5p(P<0.05)、miR-143-3p(P<0.001)、miR-145-5p(P<0.001)、miR-196b-5p(P<0.05)、miR-338-3p(P<0.05)表達(dá)在銀屑病中顯著下調(diào),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與芯片結(jié)果一致;miR-21-5p(P<0.001)miR-31-5p(P<0.001)miR-146a-5p(P<0.01)表達(dá)水平顯著升高,與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致;miR-214-5p(P>0.05)、miR-3681-5p(P>0.05)、miR-4326(P>0.05)表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)MiR-145-5p在銀屑病皮損區(qū)表達(dá)降低:FISH檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照相比,銀屑病皮損區(qū)表皮組織miR-145-5p表達(dá)降低。(3)MiR-145-5p直接靶向調(diào)控MLK3:通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的方法,運(yùn)用TargetScan,miRmap,miRandaandmiRTarbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)出MLK3為miR-145-5p潛在靶基因;使用Luciferasereporterassay的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-145-5p直接靶向調(diào)控MLK3的表達(dá)。(4)MLK3在銀屑病患者皮損區(qū)高表達(dá):qRT-PCR、免疫組化檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照相比,銀屑病皮損區(qū)MLK3在mRNA水平(P<0.01)及蛋白水平(P<0.001)表達(dá)均顯著升高。結(jié)論通過(guò)miRNA芯片篩查,發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中存在116個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(foldchange>2,P<0.05);miR-145-5p在銀屑病皮損組織中表達(dá)顯著降低,MLK3在銀屑病皮損組織中表達(dá)顯著升高;miR-145-5p直接靶向調(diào)控MLK3的表達(dá)。第二部分miR-145-5p通過(guò)靶向MLK3調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、趨化因子分泌及相關(guān)機(jī)制的研究方法:(1)人正常角質(zhì)形成細(xì)胞(normalhumanepidermalkeratinocytes,NHEKs)的分離、培養(yǎng)及傳代。(2)MiR-145-5pmimic/Ctrl、、miR-145-5pinhibitor/Ctrl及MLK3siRNA轉(zhuǎn)染。使用lipo2000轉(zhuǎn)染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM),轉(zhuǎn)染24h后使用qRT-PCR進(jìn)行miR-145-5p過(guò)表達(dá)及干擾表達(dá)情況分析。轉(zhuǎn)染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM)、siMLK3/Ctrl(60nM),然后使用qRT-PCR(轉(zhuǎn)染24h)及Westernblot(轉(zhuǎn)染48h)分析MLK3mRNA及蛋白表達(dá)情況。共轉(zhuǎn)染miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM)及siMLK3/Ctrl(60nM),分析siMLK3是否可以拮抗miR-145-5pinhibitor的生物學(xué)作用。(3)CCK-8(CCK-8proliferationassay)檢測(cè)細(xì)胞增殖。使用lipo2000分別轉(zhuǎn)染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(100nM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明確miR-145-5p及MLK3對(duì)NHEKs增殖的影響。共轉(zhuǎn)染miR-145-5pinhibitor/Ctrl(1OOnM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明確miR-145-5p對(duì)NHEKs增殖的影響是否通過(guò)MLK3介導(dǎo)。(4)液相多因子檢測(cè)試劑盒(MagneticLuminex(?)Assays)檢測(cè)不同處理后NHEKs趨化因子(CCL2、CCL7、CCL20、CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL8及CXCL-10)分泌水平。使用lipo2000分別轉(zhuǎn)染miR-145-5pmimic/Ctrl(50nM)、miR-145-5pinhibitor/Ctrl(1OOnM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明確miR-145-5p及MLK3對(duì)NHEKs趨化因子分泌的影響。共轉(zhuǎn)染miR-145-5pinhibitor/Ctrl(1OOnM)及siMLK3/Ctrl(60nM),明確miR-145-5p對(duì)NHEKs趨化因子分泌的影響是否通過(guò)MLK3介導(dǎo)。(5)使用Westernblot的方法檢測(cè)miR-145-5p及MLK3對(duì)NF-κB及STAT3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白分子表達(dá)情況的影響,探討miR-145-5p及MLK3在銀屑病中發(fā)揮作用的相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果:(1)MiR-145-5p參與調(diào)控NHEKs增殖:CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-145-5pmimic過(guò)表達(dá)miR-145-5p,可抑制NHEKs增殖;而轉(zhuǎn)染miR-145-5pinhibitor可干擾miR-145-5p表達(dá),促進(jìn)NHEKs增殖。(2)MLK3參與調(diào)控NHEKs的增殖:CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MLK3siRNA干擾MLK3的表達(dá),從而抑制NHEKs的增殖。(3)MiR-145-5p參與調(diào)控IL-17A刺激后NHEKs趨化因子的分泌:液相多因子檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)NHEKs中miR-145-5p可抑制IL-17A誘導(dǎo)的趨化因子分泌;而干擾NHEKs中miR-145-5p的表達(dá)可增加IL-17A誘導(dǎo)的趨化因子分泌。(4)MLK3參與調(diào)控IL-17A刺激后NHEKs趨化因子的分泌:MagneticLuminex(?)Assays液相多因子檢測(cè)結(jié)果顯示,干擾NHEKs中MLK3的表達(dá)可抑制IL-17A誘導(dǎo)的趨化因子分泌。(5)MiR-145-5p通過(guò)靶向MLK3調(diào)控NHEKs增殖:CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示,siMLK3可以拮抗miR-145-5pinhibitor誘導(dǎo)的NHEKs增殖,提示miR-145-5p可通過(guò)靶向MLK3調(diào)控NHEKs增殖。(6)MiR-145-5p通過(guò)靶向MLK3調(diào)控NHEKs趨化因子的分泌:miR-145-5pinhibitor可通過(guò)抑制miR-145-5p的表達(dá)促進(jìn)IL-17A誘導(dǎo)的趨化因子分泌水平,該作用可以被siMLK3拮抗,提示miR-145-5p低表達(dá)可通過(guò)MLK3促進(jìn)NHEKs趨化因子分泌。(7)MiR-145-5p通過(guò)靶向MLK3調(diào)控NHEKsNF-κB及STAT3信號(hào)通路:miR-145-5p可直接靶向調(diào)控MLK3的表達(dá),MLK3的表達(dá)水平與p-NF-KB及p-STAT3表達(dá)正相關(guān),提示miR-145-5p可通過(guò)靶向MLK3調(diào)控NF-κB及STAT3信號(hào)通路。結(jié)論:MiR-145-5p參與調(diào)控NHEKs的增殖以及趨化因子的分泌,作用可能通過(guò)靶向調(diào)控MLK3實(shí)現(xiàn);miR-145-5p通過(guò)靶向MLK3調(diào)控NF-κB及STAT3信號(hào)通路。第三部分MiR-145-5p通過(guò)調(diào)控表皮增生及皮膚炎癥參與銀屑病的發(fā)病方法:(1)使用8-10周C57雌性小鼠,背部剃毛后局部涂抹IMQ(62.5mg/d)×5d誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型。并使用改良PASI評(píng)分量表、蘇木精-伊紅染色法(HE染色)等明確銀屑病樣小鼠模型是否構(gòu)建成功。(2)通過(guò)表皮內(nèi)多點(diǎn)注射agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)過(guò)表達(dá)及干擾表皮內(nèi)miR-145-5p的表達(dá)水平。(3)通過(guò)熒光原位雜交(FISH)技術(shù),分析表皮內(nèi)轉(zhuǎn)染agomiR-145-5p(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p(1nom/d×3d)后過(guò)表達(dá)及干擾miR-145-5p表達(dá)情況。(4)使用qRT-PCR、Westernblot以及免疫組化等試驗(yàn)技術(shù)方法檢測(cè)表皮內(nèi)局部轉(zhuǎn)染agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)以及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)后,小鼠皮膚組織miR-145-5p、MLK3、CCL2、CCL20以及IL-17A的表達(dá)情況。(5)通過(guò)皮膚組織HE染色以及改良PASI評(píng)分法分析agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)對(duì)銀屑病樣小鼠模型表皮增生及小鼠皮膚炎癥程度的影響。(6)通過(guò)免疫組化技術(shù)分析銀屑病樣小鼠模型背部皮膚表皮內(nèi)局部轉(zhuǎn)染agomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)及antagomiR-145-5p/Ctrl(1nom/d×3d)對(duì)小鼠背部皮膚組織MLK3蛋白表達(dá)水平的影響,對(duì)Ki-67+細(xì)胞數(shù)量的影響,以及對(duì)CD3+T細(xì)胞及IL-17+Th17細(xì)胞趨化、募集的影響。結(jié)果:(1)外用IMQ(62.5mg/d)×5d成功誘導(dǎo)出銀屑病樣小鼠模型:皮損表現(xiàn)為小鼠背部出現(xiàn)典型的鱗屑性丘疹、斑塊,嚴(yán)重者出現(xiàn)浸漬、裂隙;HE染色顯示出典型的銀屑病病理組織學(xué)改變:角化不全,顆粒層變薄或消失,棘層增生,呈杵狀,真皮乳頭層毛細(xì)血管迂曲、擴(kuò)張,血管周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)。(2)agomiR-145-5p及antagomiR-145-5p