海洋鏈霉菌GB-2的分離篩選及其抗菌物質(zhì)的研究

海洋鏈霉菌GB-2的分離篩選及其抗菌物質(zhì)的研究海洋中蘊(yùn)藏著大量的微生物資源，在它們中廣泛地分布著抗菌活性菌株，是抗菌物質(zhì)的重要潛在來(lái)源。海洋微生物資源還是一個(gè)開發(fā)不久的新領(lǐng)域，加上海洋環(huán)境的獨(dú)特性和極端性特點(diǎn)，它們所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)往往是新穎的，可能具有很好的應(yīng)用前景。因此，從海洋中篩選產(chǎn)高效、新穎、低毒的抗菌活性物質(zhì)潛力巨大。本研究的目的在于利用我國(guó)連云港豐富的海洋微生物資源，從海洋樣品中篩選出能產(chǎn)生抗菌活性高、抗菌譜廣、安全高效的抗菌物質(zhì)的菌株，并對(duì)抗菌物質(zhì)的理化特性、組成及其對(duì)蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制效果進(jìn)行研究，旨在獲得廣譜高效、安全無(wú)毒的將來(lái)能作為食品防腐劑和飼料抗生素的新型抗菌物質(zhì)。研究結(jié)果分述如下：1．從采自連云港海域的海洋樣品中分離到667株菌，其中246株有抗菌活性，包括74株放線菌、156株細(xì)菌和16株真菌，拮抗菌株獲得比例為36.88％，以放線菌拮抗株得率為最高；選取抗菌活性強(qiáng)的11株菌進(jìn)行復(fù)篩后，發(fā)現(xiàn)11株菌株對(duì)啤酒酵母和擴(kuò)展青霉均表現(xiàn)較明顯的抑制作用；除1株菌對(duì)革蘭氏陰性菌沒(méi)有抑制作用外，其它菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有不同程度的抑制活性。這些菌株大部分有較廣泛的抗菌譜，顯示了它們較好的應(yīng)用潛力。其中放線菌GB-2的抑菌譜廣，且抑菌活性強(qiáng)，不僅能較好地抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌而且對(duì)霉菌和酵母菌也有顯著的抑菌作用。因此，確定菌株GB-2為下一步試驗(yàn)菌株。2．對(duì)放線菌GB-2進(jìn)行了分類鑒定。通過(guò)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性和細(xì)胞壁化學(xué)組分分析，初步判定其屬于鏈霉菌屬。在分子生物學(xué)鑒定中，通過(guò)總DNA提取、PCR擴(kuò)增，得到1395bp的16SrRNA序列，與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)后，應(yīng)用Bioedit7.0和Treedrawing軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，GB-2的16SrRNA序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的弗氏鏈霉菌(StreptomycesfradiaeAB184776)的序列同源性達(dá)到98％以上。經(jīng)過(guò)與已報(bào)道的弗氏鏈霉菌進(jìn)行比較分析，確定菌株GB-2為弗氏鏈霉菌變種。3．通過(guò)研究菌株GB-2的生物學(xué)活性及其抗菌物質(zhì)的理化特性發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液色澤的深淺與培養(yǎng)基鹽度密切相關(guān)，且用人工海水配制培養(yǎng)基可顯著提高菌株GB-2的抗菌活性。GB-2菌株的抑菌譜較廣，不僅對(duì)金黃色葡萄球菌及其耐藥性菌株、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性食品致病菌和腐敗細(xì)菌都有較強(qiáng)的抑制作用，而且可抑制擴(kuò)展青霉、黃曲霉、點(diǎn)青霉等食品中常見的腐敗真菌及番茄灰霉、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌等植物病原真菌。發(fā)酵液穩(wěn)定性研究表明GB-2菌株所產(chǎn)抗菌物質(zhì)在121℃pH1和pH12條件下抑菌活性均不變，紫外線照射對(duì)其抗菌活性也沒(méi)有影響，表現(xiàn)出良好的耐酸堿熱特性及對(duì)紫外線的穩(wěn)定性，在生防、食品防腐劑及醫(yī)藥方面具有較好的應(yīng)用潛力。4．菌株GB-2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)溶于水，微溶于甲醇、乙醇，不溶于其它有機(jī)溶劑中。GB-2的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)超濾后發(fā)現(xiàn)其抗菌活性由抗細(xì)菌和抗真菌兩大組分組成，其中抗細(xì)菌組分能通過(guò)截留分子量≤1KDa的超濾膜。對(duì)含抗細(xì)菌物質(zhì)的超濾液進(jìn)行紙層析，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)是一種水溶性的中性物質(zhì)。經(jīng)SephadexLH-20和SephadexG-15色譜柱分離后，過(guò)柱液經(jīng)抗菌活性檢測(cè)出現(xiàn)3個(gè)活性峰，其中a峰的對(duì)蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng)。將a峰的收集液進(jìn)一步用HPLC純化，在圖譜上出現(xiàn)兩個(gè)峰，第2個(gè)峰具有抑菌活性。根據(jù)其特性推測(cè)其可能是一種氨基糖苷類抗生素。5．研究了抗細(xì)菌物質(zhì)抑制蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌的敏感性及作用效果。結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌對(duì)其均具有較高的敏感性，最小抑菌濃度分別0.663μg/mL和0.904μg/mL，能夠較強(qiáng)地抑制這2種菌的生長(zhǎng)；菌體生長(zhǎng)曲線、膜通透性研究結(jié)果顯示加了抗細(xì)菌物質(zhì)的培養(yǎng)液菌濃下降、紫外吸收值上升，表明對(duì)這2種菌具有殺滅溶解作用；掃描電鏡和透射