Maresin1誘導(dǎo)的炎癥消散對阿爾茨海默病的保護(hù)作用

Maresin1誘導(dǎo)的炎癥消散對阿爾茨海默病的保護(hù)作用慢性炎癥是AD的主要病理改變之一,近年研究顯示導(dǎo)致慢性炎癥的主要原因是炎癥消散障礙。炎癥消散由炎癥消散因子SPMs介導(dǎo)。已有研究證實(shí)炎癥消散因子MaR1能提高神經(jīng)元生存率并增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ42的吞噬,但是MaR1在AD患者海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)顯著減低,MaR1降低可引起Aβ清除障礙、過度沉積,進(jìn)而加重炎癥反應(yīng),導(dǎo)致慢性炎癥。因此給予MaR1誘導(dǎo)炎癥消散可能成為治療AD的新方法。研究目的:明確MaR1對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化、激活、表型的極化、炎性因子分泌的影響和相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)而對AD小鼠行為學(xué)的影響。研究方法:第一部分體外實(shí)驗(yàn):1.MaR1對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化的影響的研究:原代神經(jīng)元種于6孔培養(yǎng)板底部,趨化小室置于6孔板中,將綠色熒光標(biāo)記物CFSE標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞種于趨化小室中。實(shí)驗(yàn)分八組:Vehicle組(即正常對照組)、Aβ42組、Aβ42+低濃度MaR1組(0.005μmol/L)、Aβ42+中濃度MaR1組(0.05μmol/L)、Aβ42+高濃度MaR1組(0.5μmol/L)、低濃度MaR1組(0.005μmol/L)、中濃度MaR1組(0.05μmol/L)、高濃度MaR1組(0.5μmol/L)。于6、16、24h后流式細(xì)胞儀檢測CFSE陽性細(xì)胞數(shù)分析小膠質(zhì)細(xì)胞趨化。2.MaR1對小膠質(zhì)細(xì)胞表型及激活“開-關(guān)”信號(hào)的影響:前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MaR1濃度變化對小膠質(zhì)細(xì)胞趨化影響不大,故以下實(shí)驗(yàn)MaR1只采用一個(gè)濃度;只在6h時(shí)間點(diǎn)各組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,故以下實(shí)驗(yàn)只選取6h時(shí)間點(diǎn)。小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)24h后,實(shí)驗(yàn)分組:Vehicle組、Aβ42組、MaR1組、Aβ42+MaR1組。6h后流式細(xì)胞儀分析小膠質(zhì)細(xì)胞激活“開-關(guān)”信號(hào)CD200-CD200R、表型CD40、CD183變化;CBA方法檢測共培養(yǎng)細(xì)胞上清中炎性因子、趨化因子改變;蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出現(xiàn)改變的蛋白通路,并用westernblot方法進(jìn)行驗(yàn)證。第二部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn):3-4月齡雄性C57BL6/J小鼠40只,隨機(jī)分為Vehicle組、Aβ42組、MaR1組、Aβ42+MaR1組。Aβ42組小鼠采用雙側(cè)海馬注射Aβ42制作AD動(dòng)物模型,MaR1組和Aβ42+MaR1組于海馬注射前腦室內(nèi)注射MaR1。造模后7d利用水迷宮評(píng)價(jià)小鼠行為學(xué)改變;Fluoro-JadeB染色及免疫組織化學(xué)染色方法觀察海馬和皮層神經(jīng)元退變和膠質(zhì)細(xì)胞活化;CBA和ELISA方法檢測海馬和皮層腦組織炎性因子、趨化因子水平;westernblot方法檢測體外實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)改變的蛋白通路。研究結(jié)果:第一部分體外實(shí)驗(yàn):1.與Vehicle組相比,Aβ42組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.05);Aβ42+低濃度MaR1組、Aβ42+中濃度MaR1組、Aβ42+高濃度MaR1組均較Aβ42組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目降低(P<0.05),但三種濃度組之間趨化細(xì)胞數(shù)目無顯著性差異。與Vehicle組相比,未加Aβ42的單純低濃度MaR1組、中濃度MaR1組和高濃度MaR1組趨化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目均降低,但只有低濃度MaR1組和高濃度MaR1組達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且高濃度MaR1組降低小膠質(zhì)細(xì)胞趨化作用更明顯(P<0.01)。2.在共培養(yǎng)細(xì)胞模型中,與Vehicle組相比,Aβ42組CD200R表達(dá)降低(P<0.05);Aβ42+MaR1組較Aβ42組CD200R表達(dá)升高(P<0.05)。四組CD200、CD40、CD183表達(dá)未見顯著性差異。3.在共培養(yǎng)細(xì)胞模型中,與Vehicle組相比,Aβ42組促炎性細(xì)胞因子TNF-ɑ、IL-6、趨化因子MCP-1分泌增加,抗炎性細(xì)胞因子IL-10分泌降低(P<0.05);與Aβ42組相比,Aβ42+MaR1組TNF-ɑ、IL-6分泌降低(P<0.05),MCP-1分泌有降低趨勢,IL-10分泌有增加趨勢,但是未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與Vehicle組相比,單純MaR1組IL-6分泌降低(P<0.01)。4.定量蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了四組間不同的分子變化:與Vehicle組相比,Aβ42組p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT表達(dá)降低(P<0.01),p-p38/total-p38、p-ERK/total-ERK、p-mTOR/total-mTOR、caspase3、p75NTR、Cdc42表達(dá)升高(P<0.05);與Aβ42組相比,Aβ42+MaR1組p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT、p-ERK/total-ERK表達(dá)升高(P<0.05),p-p38/total-p38、p-mTOR/total-mTOR、caspase3、p75NTR、Cdc42表達(dá)降低(P<0.05)。Westernblot驗(yàn)證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果趨勢一致。第二部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1.行為學(xué):Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)連續(xù)訓(xùn)練5天后,各組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短。在第5天,與Vehicle組相比,Aβ42組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05);與Aβ42組相比,Aβ42+MaR1組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01);Vehicle組和MaR1組逃避潛伏期無明顯差異。在探索實(shí)驗(yàn)中,Aβ42組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯少于Vehicle組(P<0.001);Aβ42+MaR1組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間高于Aβ42組(P<0.05);Vehicle組和MaR1組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間無明顯差異。2.病理:(1)Fluoro-JadeB染色:在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組退變神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.001);Aβ42+MaR1組較Aβ42組退變神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.001);Vehicle組和MaR1組退變神經(jīng)元數(shù)目無明顯差異。(2)免疫組織化學(xué)染色:在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組CD11b和GFAP陽性細(xì)胞面積百分比升高(P<0.01);Aβ42+MaR1組較Aβ42組CD11b和GFAP陽性細(xì)胞面積百分比降低(P<0.01);Vehicle組和MaR1組CD11b和GFAP陽性細(xì)胞面積百分比無明顯差異。3.腦組織炎性因子與趨化因子分泌:在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組TNF-ɑ、IL-6、MCP-1升高(P<0.05);Aβ42+MaR1組較Aβ42組TNF-ɑ、IL-6、MCP-1降低(P<0.05);Vehicle組和MaR1組TNF-ɑ、IL-6、MCP-1無明顯差異。在海馬與皮層,與Vehicle組相比,Aβ42組IL-2、IL-10升高(P<0.05);在海馬,MaR1組較Vehicle組IL-2、IL-10升高(P<0.05);在皮層,Aβ42+MaR1組較Vehicle組IL-2、IL-10升高(P<0.05)。4.蛋白通路改變:與Vehicle組相比,Aβ42組p-PI3K/total-PI3K和p-AKT/total-AKT表達(dá)降低(P<0.001),p-p38/total-p38、p-ERK/total-ERK、p-mTOR/total-mTOR、caspase3表達(dá)升高(P<0.01);與Aβ42組相比,Aβ42+MaR1組p-PI3K/total-PI3K、p-AKT/total-AKT和p-ERK/total-ERK表達(dá)升高(P<0.05),p-p38/total-p38、p-mTOR/total-mTOR、caspase3表達(dá)降低(P<0.05);與Vehicle組相比,MaR1組p-ERK