關于LacZ DNA 標記的腺病毒在高氧性肺損傷基因治療中的轉染和致炎作用

關于LacZDNA標記的腺病毒在高氧性肺損傷基因治療中的轉染和致炎作用

【摘要】目的觀察LacZDNA標記的腺病毒在高氧性肺損傷基因治療中的轉染和致炎作用。方法裝載LacZDNA的腺病毒在小鼠高氧模型開始前2天經鼻腔送入體內，X-gal染色和β-半乳糖酶活性測定用于確定LacZDNA在肺內轉染的分布及其蛋白表達產物的活性;小鼠肺干/濕重比和支氣管肺泡盥洗液(BALF)內的蛋白濃度的測定用于鑒定腺病毒在基因治療過程中可能存在的致炎作用。結果X-gal染色顯示LacZDNA在高氧前及后均可廣泛轉染在肺各級支氣管和肺泡上皮細胞，β-半乳糖酶活性的測定提示了LacZDNA可成功地翻譯成其蛋白質表達產物并表現(xiàn)為高表達;同時，腺病毒的致炎作用在高氧吸入48h后示小鼠肺干/濕重比和BALF蛋白濃度均較其他對照組明顯升高，但其升高的程度可在24h后迅速緩解上升趨勢。結論腺病毒為載體的基因治療可有效地轉染標記基因，同時，腺病毒雖在基因治療的過程中有一定的致炎作用，但是暫時的，其仍是有效的DNA載體?！娟P鍵詞】腺病毒;基因治療;LacZ;高氧性肺損傷;載體[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsofgenetransferandendogenousinflammationofadenovirusmarkedbyLacZDNAtohyperoxialunginjuryingenetherapy.MethodsAdenovirusencodedLacZDNAwasintranasaladministeredtomiceat2daysearlierbefore100%O2inhalation，X-galstainingandactivitymeasurementofβ-galproteintranslatedfromLacZDNAwereappliedtodeterminethelevelofLacZDNAtransferandit'sproteinexpression;meanwhile，mouselungwet/dryratioandproteinconcentrationinbronchusalveolarfluidweremeasuredtovaluatethedegreeofinflammationreactionfromadenovirus.ResultsX-galstainingshowedLacZDNAcouldtransferbroadlyinseriesoflungbronchusandalveolarepithelialcellsnomatterbeforeorafter100%O2inhalation;β-galproteinactivitymeasurementpresentedLacZDNAcouldsuccessfullytranslatedintoit'sproteinexpressionwithhighlevelexpression;meanwhile，endogenousinflammationofadenovirusshowedmouselungwet/dryratioandproteinconcentrationinbronchusalveolarfluidweresignificantlyincreasedatthe48hof100%O2inhalationcomparedtocontrolgroups，butlostthepatternofcontinueincreasingafteranthercontinual24hof100%O2inhalation.ConclusionBeingvectorofgenetherapy，adenoviruscouldsuccessfullytransfertargetDNA，while，adenoviruswouldbringsomedegreeofendogenousinflammation，butitistemporarily，itisstillavalidityvectoringenetherapy.[Keywords]adenovirus;genetherapy;LacZ;hyperoxialunginjury;vector基因治療(genetherapy)是指將外源正?；蛲ㄟ^載體導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當?shù)氖荏w細胞中，使外源基因制造的產物能治療某種疾病。攜帶基因進入細胞內表達的載體有病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體又分腺病毒、腺病毒相關病毒、逆轉錄病毒載體等;非病毒載體包括脂質體、磷酸鈣、基因槍等。腺病毒是基因治療的主要載體，并占所有基因治療研究中的28%[1，2]。急性肺損傷(ALI)是嚴重威脅生命安全的常見急危重癥，其病死率在我國高達60%～70%。傳統(tǒng)的ALI治療方案對挽救生命和疾病轉歸影響有限[3]，因此，嘗試新的治療手段如基因治療已是目前研究的熱點。然而，關于腺病毒自身的致炎作用在以其為載體的基因治療對ALI治療效果影響的報道尚少見。本研究在建立小鼠ALI疾病模型的基礎上，觀察了腺病毒的轉染和致炎作用對小鼠ALI基因治療效果的影響及意義。1材料與方法1.1材料動物：本所研究使用的小鼠均獲得美國賓夕法尼亞大學動物部批準。小鼠隨機性分為4組：(1)氧氣吸入前對照組(Con組)15只;(2)LacZDNA標記的腺病毒治療組(AdLacZ組)20只;(3)磷酸鹽緩沖液(PBS)治療組(PBS組)20只;(4)無治療組(無治療組)20只。1.2方法1.2.1經鼻腔通道的治療方法在100%O2暴露前2天，根據小鼠體重將腺病毒濃縮制劑用緩沖劑調整到每只小鼠給藥50μl，并將總容量分為4次在小鼠麻醉狀態(tài)下呈垂直位時經鼻腔吸入。1.2.2高氧性肺損傷模型各組小鼠隨機取樣后，將他們同時暴露于100%O2灌注的氧艙內以制造高氧性肺損傷動物模型。氧艙內氧流量為6～8L/min，艙內氧氣交換頻率是6～7次/h，CO2<0.2%，濕度約45%，并維持約12h的白天黑夜交替。在100%O2吸入后的24、48和72h，分別收集肺組織和肺泡灌洗液等標本以備檢測之用。1.2.3標本的收集和處理在高氧吸入前及后的24、48和72h，應用苯巴比妥(50mg/kg)腹腔深度麻醉小鼠后，暴露小鼠主氣管并行氣管插管和機械通氣。沿胸腹中線切開皮膚和腹部皮下組織以暴露腹腔臟器和腹主動脈。隔斷腹主動脈放血以減少肺部血流量，隨后，打開胸腔，分離心臟及肺旁結締組織，并經右心室穿刺，肺泡灌流液以20～30cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)水壓經右心室灌流肺組織，至肺組織內血液沖洗干凈。分離出的肺組織在液氮中快速冷藏，并將肺標本保存在-80℃的冰箱內以備用。另外，在機械通氣后及肺泡灌流之前，用注射器灌洗肺泡3次，并收集支氣管-肺泡灌洗液。灌洗后的肺組織經由主氣管灌入4%的甲醛溶液至肺泡內以備用于肺組織的細胞化學染色。1.2.4X-gal染色β-半乳糖酶(X-gal)染色[4]可以提供LacZDNA整合到肺上皮細胞DNA后的蛋白表達分布的影像學分析。新鮮整體肺組織在福爾馬林液內固定并徹底漂洗后，在X-gal復合試劑(K4Fe(CN)6-3H2O，K3Fe(CN)6，2mMMgCl2and0.5mg/mlofX-gal)內孵育過夜。次日，PBS漂洗后，觀察肺組織X-gal顏色后的藍色深淺程度及范圍并攝片記錄。染色后的整體肺組織依次通過10%、20%和30%蔗糖溶液再次固定。隨后，將肺組織包埋在OCT復合物并在液氮中迅速冷凍成型。沿氣管縱軸將肺組織切成厚度為10μm的切片;核紅試劑復合染色后，可在熒光顯微鏡下觀察攝片(200倍)。1.2.5β-半乳糖酶活性測定[5]10mg肺組織在0.25mol/LTris-HCl的均漿緩沖液中快速勻漿。200μl鄰硝基酚半乳糖甙反應底物和900μl含-巰基乙醇的裂解試劑混勻后加入100μl肺組織勻漿并孵育在37℃至產生O-硝基吡喃(ONP)，該產物可在波長420nm的分光光度儀測定。同時，以牛γ球蛋白為標準物測定肺組織均漿內的蛋白濃度，β-半乳糖酶的活性表達為單位/毫克蛋白(U/mg)。1.2.6肺干/濕重比測定小鼠經苯巴比妥腹腔深度麻醉后，暴露氣管并行氣管插管和機械通氣。開胸后，直接留取肺組織，在迅速吸收肺組織外液體后，稱重后即紀錄為肺濕重，并送入烘干箱內烘干，約72h后，至反復測量肺重量無變化后，記錄為肺干重。1.2.7支氣管肺泡盥洗液內蛋白濃度測定小鼠經氣管插管收集支氣管-肺泡灌洗液，收集到的灌洗液離心后取其上清液用于蛋白濃度測定，方法采用以牛γ球蛋白為標準物的蛋白濃度測定法。1.3統(tǒng)計學分析數(shù)據表達為(x±s)。使用美國SigmaStat統(tǒng)計分析軟件用于顯著性差異分析，t檢驗用于兩組之間顯著性差異統(tǒng)計學分析;One-wayANOVA檢驗用于多組之間的顯著性差異統(tǒng)計學分析。2結果2.1腺病毒為載體的LacZDNA在肺內轉染的分布及表達活性小鼠在100%O2吸入前2天經鼻腔吸入裝載LacZDNA的腺病毒，并在100%O2吸入開始時，收集標本并應用X-gal染色以了解LacZ基因在肺內轉染的分布;同時，在100%O2吸入開始時及后24、48和72h分別收集肺組織以測定LacZDNA表達蛋白β-半乳糖酶的活性。X-gal染色結果顯示LacZDNA可在整肺和肺各級支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞的廣泛轉染和分布如藍色顆粒所示(圖1A、B);LacZDNA的蛋白表達產物β-gal的活性在100%O2吸入前即可被測出，同時，在高氧吸入24、48和72h，β-半乳糖酶的蛋白表達活性呈現(xiàn)持續(xù)有效的肺內高表達(分別為3.728、4.034、3.688U/mg)，并且，在高氧吸入后72h，該蛋白活性的表達仍維持為高氧吸入前水平的2倍以上(表1)。表1β-半乳糖酶的活性2.2腺病毒載體在高氧性肺損傷基因治療中的致炎作用肺干/濕重比隨高氧暴露時間的延長，呈時間-依賴性升高。100%O2吸入48h后，AdLacZ組小鼠的肺干/濕重比和無治療組小鼠相比，差異有顯著性;但在繼續(xù)O2吸入24h后，雖然，AdLacZ組的肺干/濕重比仍維持在較高水平，但和其他兩對照組相比，差異無顯著性(圖2)。AdLacZ組小鼠的支氣管-肺泡灌洗液內的蛋白濃度，在高氧吸入的24h和48h，和無治療組相比，差異有顯著性;而在高氧吸入后的72h，各組小鼠的支氣管-肺泡灌洗液內的蛋白濃度的數(shù)值已基本上維持在相似的水平。3討論基因治療是21世紀新興的分子生物學醫(yī)學，它是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學高新技術。自1989年Rosenberg首次將基因標記導入黑色素瘤病以來，基因治療作為治療疾病的一種超前手段，正愈來愈受到人們的重視和關注。目前基因治療已廣泛地應用于多種遺傳性疾病和后天獲得性疾病的嘗試性的治療實踐中，其中全世界有四種病例已確定有肯定療效，即：聯(lián)合免疫缺陷癥(ADA)、血友病B、家族性高膽固醇血癥和遺傳性肺氣腫[6，7]。基因治療成功的關鍵是選用理想的基因載體，并通過基因載體獨特的基因轉染性，將靶基因有效持續(xù)地轉染到目標細胞DNA內，同時，該基因載體的結構設計還需最大限度地避免載體本身所引發(fā)的毒副反應的發(fā)生。目前數(shù)十種有潛力的基因載體已廣泛的應用于基因治療的動物或臨床研究中[2，8]，其中腺病毒用于基因載體的研究居首位。這不僅是因為腺病毒具有很強的基因轉染性，同時還具有其他載體少有的可轉染大片段靶DNA的能力。雖然，腺病毒自身的病原毒副反應可引發(fā)機體炎癥反應，從而限制了基因治療的成功率，但隨著對腺病毒載體結構設計改進的研究，腺病毒自身的毒副反應對基因治療效果的影響已有了明顯減少的趨勢[8]。LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，1969年，美國哈佛大學以Beckwith博士為首的研究小組，應用DNA分子雜交技術首次分離到該基因。LacZ基因編碼的β-半乳糖酶(簡稱β-gal)是由4個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解，β-gal比較穩(wěn)定，用X-gal為底物進行染色時，呈藍色，便于檢測和觀察。LacZ基因的諸多優(yōu)點使它成為基因工程實驗中的一個常用標記基因[4，5]。小兒急性肺損傷(ALI)是由各種直接和間接致傷因素所導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，可造成彌漫性肺間質及肺泡水腫的病理生理改變而出現(xiàn)的臨床綜合征。隨著對ALI經典的治療方法如呼吸支持或藥物治療的改進與發(fā)展，ALI的病死率有所下降，但死亡率仍然波動在較高程度。近十幾年來，嘗試不同的新的研究方法以發(fā)現(xiàn)降低ALI病死率的有效治療手段是科學家努力的方向[3]。在這其中，以基因治療最有希望從遺傳物質角度上根本地改變患者ALI發(fā)病的基因傾向性，從而改善ALI的嚴重性和預后。腺病毒載體是基因治療中應用最廣泛的載體，其介導的基因治療在肺損傷的治療中多有成功的報道，但腺病毒在應用于高氧性肺損傷治療中的副作用尚未有報道，因此，本研究觀察了腺病毒介導的基因治療對高氧性肺損傷的炎癥反應的影響以及其應用于ALI治療的價值。肺擁有最龐大的上皮細胞-毛細血管網，具有獨特的適合接受經鼻腔等給藥的條件[9，10]。筆者應用了經鼻腔滴入裝載LacZDNA的腺病毒制劑并觀察研究了腺病毒轉染LacZDNA到肺上皮細胞的效果以及腺病毒相關的肺部炎癥反應程度。發(fā)現(xiàn)腺病毒可引導LacZDNA在肺各級