巴參菜活性多糖制備及抗腫瘤、保肝活性研究

巴參菜活性多糖制備及抗腫瘤、保肝活性研究巴參菜(Talinumtriangulare(Jacq.)Willd)又名棱軸土人參、人參菜、菜用土人參,屬馬齒莧科土人參屬,為多年生草本植物,原產(chǎn)于非洲、南美、印度等熱帶地區(qū),具有極高的食用和藥用價(jià)值,其在民間常用于抗腫瘤和治療肝臟疾病。本文對(duì)巴參菜多糖(PolysaccharidesofTalinumtriangulare,TTP)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并采用體外抗氧化評(píng)價(jià)體系考察了其抗氧化活性；采用生化指標(biāo)分析及組織病理學(xué)切片評(píng)價(jià)了TTP體內(nèi)對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷模型鼠的保護(hù)作用；借助流式細(xì)胞儀及PCR等技術(shù)探討了TTP免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤機(jī)制；利用柱層析技術(shù)對(duì)TTP進(jìn)行了分級(jí)純化,并用GC、IR和NMR等手段對(duì)TTP級(jí)分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征,以探討其活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。本文主要研究結(jié)果如下：(1)TTP提取工藝優(yōu)化：通過(guò)單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化巴參菜多糖TTP的提取工藝,以TTP得率為指標(biāo),確定了其最佳提取工藝為：提取溫度100℃、提取時(shí)間2.0h、料液比1：25,從經(jīng)濟(jì)的角度看,考慮到得率及后續(xù)濃縮等因素,宜采用兩次提取法,粗多糖TTP得率為14.99%。(2)TTP體外抗氧化活性評(píng)價(jià)采用H202/Fe2+體系、焦性沒(méi)食子酸自氧化法結(jié)合總還原能力測(cè)定等,考察了巴參菜多糖的抗氧化性能。結(jié)果顯示：巴參菜多糖具有較好的清除羥自由基(2.0mg/mL40%7,醇沉淀TTP級(jí)分,抑制率為89.80%)、超氧陰離子自由基(5.0mg/mL40%71醇沉淀TTP級(jí)分,抑制率為63.23%)等活性,并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。(3)TTP對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及免疫體系影響TTP對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,200mg/kg·bw劑量TTP抑瘤率達(dá)49.07%：與模型組相比,200mg/kg·bwTTP處理組脾臟指數(shù)極顯著升高(P<0.001),細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2含量亦極顯著增加(P<0.01～0.001),宿主免疫力顯著增強(qiáng),表明TTP抗腫瘤機(jī)理與其免疫增強(qiáng)作用有關(guān)。(4)TTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)及對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制TTP可以明顯激活小鼠原代巨噬細(xì)胞PMM,與空白對(duì)照組相比,200μg/mL劑量TTP能促進(jìn)PMM增殖,其增殖率達(dá)135.39%,與陽(yáng)性對(duì)照脂多糖的促增殖作用(5μg/mL,PMM增殖率146.46%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：TTP處理RAW264.7細(xì)胞后,其上清液中NO含量急劇增加(P<0.001),MMT試驗(yàn)及細(xì)胞流式結(jié)果顯示上清液細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng),各劑量TTP組對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率達(dá)到或超過(guò)了60%：RT-PCR結(jié)果顯示iNOS基因表達(dá)顯著提高,與化學(xué)指標(biāo)相吻合；TLR2/4基因表達(dá)亦顯著增加,提示巴參菜多糖可通過(guò)TLR2/4受體通路激活巨噬細(xì)胞。(5)TTP對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用TTP對(duì)小鼠CC14誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用,能顯著抑制由于CC14中毒造成的GSH含量及SOD活性及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成,200mg/kg·bwTTP給藥的保肝效果與50mg/kg·bw水飛薊素(臨床用保肝藥物)接近,TTP的保肝機(jī)理與其增強(qiáng)抗氧化酶活性,清除或抑制自由基生產(chǎn)及免疫調(diào)節(jié)活性有關(guān)。(6)TTP柱層析分離純化及結(jié)構(gòu)表征通過(guò)DEAE-52柱及SephadexG-100柱對(duì)TTP分離純化,獲得TTP-1與TTP-4兩種均一多糖級(jí)分：TTP-4分子量為87.4kDa,以β-TTP糖苷鍵形式存在,β-消化反應(yīng)表明多糖TTP-4中存在O-糖苷鍵,氣相色譜顯示TTP-4由Rh