細胞因子的檢測和應(yīng)用

關(guān)于細胞因子的檢測和應(yīng)用發(fā)展歷史和命名

1966年-巨噬細胞移動抑制因子1969年提出了“淋巴因子”的概念此后，又提出了“單核因子”的概念(由于如此眾多的免疫活性因子的發(fā)現(xiàn)，且鑒于對其本質(zhì)尚不清楚，均以其生物學(xué)活性命名，致使這些因子的名稱相當(dāng)混亂。)1979年在瑞士召開的第二屆淋巴因子國際會議上提出了白細胞介素的概念,并按發(fā)現(xiàn)順序以阿拉伯?dāng)?shù)字排列。尚有其它細胞分泌的活性介質(zhì)，如IFN-α和IFN－β分別由白細胞和纖維母細胞產(chǎn)生。目前將所有這些因子統(tǒng)稱為細胞因子。

第2頁,共46頁，2024年2月25日，星期天概述

概念細胞因子（cytokine）是指由活化的免疫細胞（包括淋巴細胞和非淋巴細胞）和某些基質(zhì)細胞分泌的、介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的小分子多肽類因子，它們是除免疫球蛋白和補體之外的另一類非特異性免疫效應(yīng)物質(zhì)

。產(chǎn)生細胞因子的細胞種類很多，但歸納起來主要有三類：①活化的免疫細胞，包括淋巴細胞、單核／巨噬細胞、大顆粒淋巴細胞、粒細胞、肥大細胞等；②基質(zhì)細胞類，包括骨髓和胸腺的基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞等；③某些腫瘤細胞系。產(chǎn)生：抗原、致分裂原、感染、炎癥等多種因素可刺激細胞因子的產(chǎn)生，各細胞因子之間也有相互刺激合成和分泌的作用。

第3頁,共46頁，2024年2月25日，星期天共同特點

1)正常休止?fàn)顟B(tài)的細胞必須經(jīng)刺激和活化后才能合成和分泌CKs,細胞內(nèi)無細胞因子前體儲存,接受刺激后從激活基因開始至合成,分泌,刺激結(jié)束后細胞因子的產(chǎn)生隨即停止.。2）絕大多數(shù)CKs均為低分子量（4～80kD）的糖蛋白。3）分泌特性：大多數(shù)的CKs是通過旁分泌（paracrine），或自分泌（autocrine），少部分通過內(nèi)分泌的形式作用于遠處靶細胞或靶器官；4）多樣性：一種細胞可產(chǎn)生多種細胞因子，不同類型細胞也可產(chǎn)生一種或幾種相同的細胞因子。

5）網(wǎng)絡(luò)性：協(xié)同效應(yīng)；重疊效應(yīng)；拮抗效應(yīng)。

6）高效性：它們的受體親和力高，表現(xiàn)很強的生物學(xué)活性，是免疫球蛋白等分子遠不能及的。7)非特異性:細胞因子多由免疫細胞在特定抗原或絲裂原刺激下所產(chǎn)生,但其對靶細胞發(fā)揮功能卻為非特異性,也不受MHC限制.第4頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3．分類白細胞介素（interferon）IL干擾素（interferon）IFN腫瘤壞死因子（TNF）集落刺激因子（CSF）生長因子（growfactor）GF趨化因子第5頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞因子檢測受體檢測技術(shù)

生物學(xué)細胞增殖靶細胞殺傷

趨化活性誘導(dǎo)產(chǎn)物細胞病變抑制分子生物學(xué)DNARNA檢測ELISA免疫學(xué)流式細胞技術(shù)第6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天生物學(xué)檢測法

(1)細胞增殖法依賴細胞株：許多細胞因子具有細胞生長因子活性，利用這一特性，現(xiàn)已篩選出一些對特定細胞因子起反應(yīng)的細胞，并建立了只依賴于某種因子的細胞系，即依賴細胞株（簡稱依賴株）。這些依賴株在通常情況下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依賴株CTLL-2在不含IL-2的培養(yǎng)基中很快死亡，而加入IL-2后則可在體外長期培養(yǎng)。在一定濃度范圍內(nèi)，細胞增殖與IL-2量成正比。除依賴株外，還有一些短期培養(yǎng)的細胞，如胸腺細胞、骨髓細胞、促有絲分裂原刺激后的淋巴母細胞等，均可作為靶細胞來測定某種因子活性。

第7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3H-TdR摻入法原理：將3H-TdR作為DNA合成的原料摻入到新增殖的細胞中，細胞DNA合成的增加或減少而間接判斷細胞增殖的方法，而用放射物質(zhì)標(biāo)記的胸腺嘧啶則可代表細胞DNA的增值程度，通過與細胞因子標(biāo)準(zhǔn)品比較，而推算出待測標(biāo)本中細胞因子的含量。第8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天步驟：1．依賴細胞株的培養(yǎng)。用血細胞計數(shù)儀測定細胞密度，取適當(dāng)體積的細胞用于測定。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗細胞兩次后，測定細胞活力（應(yīng)>80%），并以測定培養(yǎng)液重懸細胞至合適終濃度用以測定。表１５－１提供了參考。２．用細胞因子標(biāo)準(zhǔn)品建立一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，并設(shè)置已知含測定培養(yǎng)液的質(zhì)控孔。３．適當(dāng)稀釋待測標(biāo)本，加入微孔板中雙份重復(fù)測定。４．每孔中加入細胞懸液，置于濕潤的CO2培養(yǎng)箱中３７℃培養(yǎng)。（培養(yǎng)時間按所用細胞株而定）５．加入3H標(biāo)記的胸腺嘧啶，在置于CO2培養(yǎng)箱中３７℃培養(yǎng)約4h。６．收集細胞于玻璃纖維濾紙上，是用液體閃爍儀測定放射活性。此方法優(yōu)點是易于自動化，測定的信噪比最好，可常規(guī)用于大標(biāo)本量的測定。缺點是使用放射性核素，試驗廢物處理麻煩。第9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天MTT法

MTT（四唑鹽）比色法是一種檢測細胞存活和增殖的方法，所用的顯色劑是一種能接受氫原子的化合物MTT。原理是，活細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍紫色的結(jié)晶formazan，后者的產(chǎn)量與活細胞數(shù)成正相關(guān)。formazan可用DMSO、無水乙醇或酸化異丙醇等溶解，在酶標(biāo)儀上以波長620nm進行比色。所檢測的OD值的大小可反應(yīng)細胞代謝活性的強弱。優(yōu)點：靈敏度高，操作簡便，自動化。缺點：影響因素多，重復(fù)性較差。注意：MTT有毒性致突變性，操作時應(yīng)注意防護。第10頁,共46頁，2024年2月25日，星期天(2)靶細胞殺傷法

根據(jù)某些細胞因子（如TNF）能在體外殺傷靶細胞而設(shè)計的檢測方法。通常靶細胞多選擇體外長期傳代的腫瘤細胞株，利用同位素方法或顏料染色等方法判定細胞的殺傷率。一般活細胞的檢測可采用染料甲紫、萘酚藍黑、MTT等使細胞著色，再用脫色液將燃料脫出，然后用酶標(biāo)儀比色來反映細胞存活狀態(tài)。第11頁,共46頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)孔特定細胞株加入TNF37℃MTT酶標(biāo)儀比色吸光度與細胞因子的量成反比，用細胞因子標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度作線性曲線，便可得到特定細胞因子的含量。第12頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

(3)趨化活性測定法本法主要用于趨化因子和IL-8的生物學(xué)活性測定。趨化性細胞因子主要由白細胞與造血微環(huán)境中的基質(zhì)細胞分泌，可結(jié)合在內(nèi)皮細胞的表面，具有對中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的趨化性（chemotaxis）和化學(xué)增活性（chemokinesis）。趨化性指趨化因子誘導(dǎo)細胞有趨化因子濃度低的地方向濃度高的地方移動的特性，可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗測定；化學(xué)增活性是指其增強細胞運動能力的特性，可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動力學(xué)實驗測定。第13頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3~5μm孔徑的微孔濾膜靶細胞濾液受檢的趨化因子３７℃溫育數(shù)小時取膜固定、干燥、著染、脫色將透明后的濾膜置油鏡下檢測細胞在膜內(nèi)通過距離，求其趨化單位濾膜微孔小室法第14頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞懸液對照培養(yǎng)液趨化因子或待測液將含小牛血清的1%瓊脂糖傾于平皿，如上圖操作后經(jīng)３７℃溫育后，用2%戊二醛固定，除去瓊脂糖層，經(jīng)染色后，測量細胞運動的距離，計算移動指數(shù)。移動指數(shù)=趨化移動距離/任意移動距離瓊脂糖平板法第15頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

(4)細胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法某些細胞因子可刺激特定細胞產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如IL-2誘導(dǎo)骨髓細胞合成組胺、IL-6誘導(dǎo)肝細胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通過測定所誘生的相應(yīng)產(chǎn)物，可反映細胞因子的活性(5)細胞病變抑制法

病毒可造成靶細胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導(dǎo)致的細胞病變，因此可利用細胞病變抑制法檢測這類因子。第16頁,共46頁，2024年2月25日，星期天免疫學(xué)檢測法

細胞因子均為蛋白或多肽，具有較強的抗原性。隨著重組細胞因子的出現(xiàn)，可較方便制得細胞因子的特異性抗血清或單克隆抗體，因此盡管細胞因子的種類繁多，只要獲得了針對某一因子的特異性抗體（包括多克隆抗體或單克隆抗體）均可采用相似的技術(shù)開展工作。常用的方法有ELISA、RIA及免疫印跡法等。目前，幾乎所有常見細胞因子的檢測試劑盒均有商品供應(yīng)。第17頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式細胞技術(shù)

flowcytometry

可以測定單個細胞因子產(chǎn)生特性。原理：熒光素標(biāo)記的細胞因子特異的單克隆抗體，在一定條件下，與活化的靶細胞內(nèi)的特異細胞因子結(jié)合，然后用流式細胞儀分析熒光標(biāo)記的陽性細胞百分率和平均熒光強度，其與細胞內(nèi)細胞因子的含量成正比。第18頁,共46頁，2024年2月25日，星期天流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)細胞因子

cytokinesincellDetection

byflowcytometry

分離待測細胞活化細胞（莫能菌素（monensin)和布雷菲爾德菌素）封閉細胞表面Fc受體（脫脂奶）細胞表面抗原染色固定和通透細胞膜（多聚甲醛）細胞內(nèi)細胞因子染色流式細胞分析第19頁,共46頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共46頁，2024年2月25日，星期天分子生物學(xué)檢測法

(DNA)１．提取細胞基因組的DNA，將其用限制性核酸內(nèi)切酶切，２．再做瓊脂糖凝膠電泳將酶切DNA片斷分離，３．將經(jīng)變性的DNA片斷轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，４．用相應(yīng)細胞因子的核酸探針來檢測其特定DNA序列結(jié)構(gòu)。可進行基因的定性及定量、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RLFP）等。SOUTHERNBLOT第21頁,共46頁，2024年2月25日，星期天重物500g吸水紙濾紙轉(zhuǎn)移膜凝膠濾紙雜交緩沖液玻璃支撐Southernblot第22頁,共46頁，2024年2月25日，星期天分子生物學(xué)檢測法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR可用于檢測細胞因子基因有無缺失、突變，當(dāng)有缺失時則缺少擴增的DNA片斷，而當(dāng)基因突變時可產(chǎn)生新的酶切位點或原有的內(nèi)切酶位點喪失，經(jīng)RLFP或PCR結(jié)合序列特異寡核苷酸探針斑點雜交分析可發(fā)現(xiàn)突變的基因，如嚴格控制雜交及洗膜條件，可發(fā)現(xiàn)單個堿基的突變；還可應(yīng)用PCR結(jié)合序列特異引物及上述兩種方法檢測某些細胞因子的多態(tài)性。第23頁,共46頁，2024年2月25日，星期天實時熒光PCR技術(shù)特點：實時（realtime)測定，靶核酸擴增和產(chǎn)物檢測同時完成，擴增管在整個測定過程中完全處于閉管狀態(tài)，不容易出現(xiàn)擴增產(chǎn)物對實驗室的“污染”，對實驗技術(shù)人員的測定操作及實驗室設(shè)置的要求都相對要低一些。TaqMan技術(shù)“分子信標(biāo)”技術(shù)第24頁,共46頁，2024年2月25日，星期天TaqMan技術(shù)oCH2OPOH5’端標(biāo)記報告熒光3’端標(biāo)記淬滅熒光沒有雜交，距離近而發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移樣本中原始模板的數(shù)量與熒光強度超出選定閾值時的擴增循環(huán)數(shù)（Ct)成反比TaqMan聚合酶第25頁,共46頁，2024年2月25日，星期天“分子信標(biāo)”技術(shù)5’3’第26頁,共46頁，2024年2月25日，星期天分子生物學(xué)檢測法(mRNA)Northern印跡雜交本方法有一定的限制性，因為mRNA的穩(wěn)定性及其降解速率直接影響細胞內(nèi)mRNA的積累量，因此用細胞總RNA作Northern印跡雜交，其結(jié)果不能完全反映mRNA的轉(zhuǎn)錄活性。反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）細胞因子的mRNA壽命短、拷貝數(shù)低，難以在小量樣本中進行檢測。RT-PCR能檢測細胞內(nèi)低豐度特異mRNA的方法。第27頁,共46頁，2024年2月25日，星期天原位雜交將標(biāo)記的特異DNA或RNA探針與細胞內(nèi)染色體上相應(yīng)的DNA形成穩(wěn)定的雜交體。此法可用于細胞因子基因的組織細胞及染色體定位。原位PCR原位雜交的應(yīng)用受到其敏感性的影響，而細胞因子的基因均為單拷貝，有時不能被檢出。原位PCR就是以特定的DNA或RNA為模板，在細胞核內(nèi)原位進行擴增。而擴增產(chǎn)物因分子較大，或互相交織，不宜透過細胞膜而保留在原位。在應(yīng)用原位雜交技術(shù)將其檢出。第28頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞因子受體檢測技術(shù)

細胞因子的生物學(xué)活性是通過其相應(yīng)的受體發(fā)揮作用的，細胞因子受體檢測已成為基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)研究的重要內(nèi)容。本節(jié)主要介紹細胞因子受體檢測的基本方法?；罴毎赵囼瀸⑦^量的待測細胞與有限的細胞因子共育，若細胞膜表面存在相應(yīng)的受體即可吸收細胞因子，通過測定回收后細胞因子生物活性喪失情況可確定受體是否存在。此法簡便，適用于定性。第29頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞因子受體檢測技術(shù)放射性核素標(biāo)記重組配體的放射受體分析本方法是確定細胞受體分布及其特性的主要方法，可測定受體的數(shù)量及親和力。通常采用放射性核素示蹤，如體外標(biāo)記重組細胞因子，通過生物合成的標(biāo)記重組細胞因子的功能不受影響，受體單克隆抗體標(biāo)記分析技術(shù)抗細胞因子受體的McAb既可封閉受體抑制相應(yīng)細胞因子的生物活性，也可用標(biāo)記的McAb直接做免疫放射受體分析或免疫共沉淀。第30頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞因子受體檢測技術(shù)受體cDNA分析酶免疫技術(shù)檢測法某些細胞因子受體除存在于細胞膜外，尚可分泌進入體液，稱為可溶性細胞因子受體（solublecytokinereceptor）,如sIL-2R、sIL-4R和sIFN-γR。這類受體多采用ELISA法檢測。重組細胞因子與受體的交聯(lián)分析利用化學(xué)交聯(lián)劑將標(biāo)記的重組細胞因子與膜受體交聯(lián)，細胞裂解物經(jīng)PAGE電泳后作放射自顯影分析，通過帶型分析可確定受體的分子量及亞單位。第31頁,共46頁，2024年2月25日，星期天三種細胞因子測定方法的比較

生物學(xué)檢測法：比較敏感，直接測定生物學(xué)功能，可靠，但需培養(yǎng)依賴性細胞株、耗時長、步驟繁，影響因素多，不易掌握。免疫學(xué)檢測法：操作較簡便、快速、重復(fù)性好、尚可測定特定細胞或亞群產(chǎn)生細胞因子的含量，但敏感度比生物學(xué)法低10~100倍。免疫學(xué)檢測法檢測的是細胞因子蛋白質(zhì)的抗原性，可能是無活性的變性分子或細胞因子的裂解片斷。分子生物學(xué)檢測法：只能代表基因表達情況，不能提供細胞因子的濃度及活性等資料。第32頁,共46頁，2024年2月25日，星期天生物學(xué)活性法免疫學(xué)檢測法原理生物學(xué)活性水平特異性結(jié)合反應(yīng)敏感性一般較高(受體)一般較低(加放大系統(tǒng)可明顯升高)特異性低高(識別類型、亞型)(不能)(有可能)周期較長短培養(yǎng)條件大小指示細胞敏感性差異大/指示細胞突變可發(fā)生/生物學(xué)作用相同因子擾大小樣品中特異性或非特異性抑制物干擾大小重復(fù)性較差較好標(biāo)準(zhǔn)化、大量檢測困難容易第33頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞因子測定的臨床應(yīng)用原則應(yīng)使用多種方法測定測定標(biāo)本選擇適當(dāng)（血液、局部炎癥分泌物、細胞、疾病的動態(tài)觀察）同時測定多種細胞因子（了解T細胞、巨噬細胞、和上皮樣細胞分泌細胞因子的功能）第34頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞因子測定的臨床應(yīng)用特定疾病的輔助診斷評估機體的免疫狀態(tài)臨床疾病的治療應(yīng)用臨床疾病的預(yù)防應(yīng)用第35頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞因子測定的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀雖然已知較多的細胞因子，但僅僅少數(shù)用于臨床常規(guī)檢查，如IL-6、IL-8、TNF-α。由于細胞因子的基因多效性和復(fù)雜性，并無哪一種細胞因子能作為某一特定疾病的標(biāo)志。由于某一細胞因子穩(wěn)態(tài)的漂移和疾病的特異性損傷有關(guān)，因此對于評價一種疾病的活動狀況是非常重要的新生兒敗血癥患者出生后幾小時，IL-6和IL-8升高，這項檢查具有較高的臨床靈敏度和特異性，而使用傳統(tǒng)的急性相蛋白如CRP則要在24~48小時才升高。測定體液中炎癥相關(guān)的細胞因子也具有臨床意義。第36頁,共46頁，2024年2月25日，星期天粘附分子的檢測及應(yīng)用

尹向飛第37頁,共46頁，2024年2月25日，星期天細胞粘附分子（celladhesion

molecules,CAM）是眾多介導(dǎo)細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱。粘附分子以受體－配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，是細胞與細胞間，細胞與基質(zhì)間，或細胞－基質(zhì)－細胞間發(fā)生粘附，參與細胞的識別，細胞的活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞的增值與分化，細胞的伸展與移動，是免疫應(yīng)答、免疫發(fā)生、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過程的分子基礎(chǔ)。

概述第38頁,共46頁，2024年2月25日，星期天分類：據(jù)結(jié)構(gòu)特征可分為整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家（IgSF）、鈣粘蛋白家族等。存在形式：細胞膜表面表達和可溶性兩種形式。含量：正常情況下可溶性粘附分子含量很低，在病理情況下由于細胞因子、內(nèi)毒素或凝血酶的參與，細胞膜表面的ＡＭ釋放或合成無跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的小分子量ＡＭ。

概述第39頁,共46頁，2024年2月25日，星期天

概述手術(shù)切片、細胞（淋巴、內(nèi)皮細胞等）、組織細胞提取物、血液或其他體液等。測定標(biāo)本檢測現(xiàn)狀目前的檢測方法，大多限于用免疫學(xué)技術(shù)檢測其數(shù)量，而有關(guān)分子的親和力及擴散速率的檢測方法正在建立中。第40頁,共46頁，2024年2月25