粵特色藥材雞骨草及混淆品毛雞骨草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

粵特色藥材雞骨草及混淆品毛雞骨草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究【摘要】目的：分析雞骨草和混淆品毛雞骨草的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，為評(píng)價(jià)雞骨草的質(zhì)量和雞骨草與毛雞骨草的真?zhèn)舞b別提供了有效的方法。方法：采用2020年版《中國(guó)藥典》通則方法，通過(guò)性狀、顯微及TLC鑒定進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜分析，特征圖譜采用AgilentC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相甲醇-5mmol磷酸二氫鉀進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為280、330nm；流速0.8mL.min-1。含量測(cè)定采用XBridgeC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相甲醇-水-磷酸-三乙胺(12∶88∶0.36∶0.16)；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；體積流量0.8ml.min-1。結(jié)果：建立的性狀鑒定、顯微特征方法準(zhǔn)確簡(jiǎn)便，樣品薄層色譜斑點(diǎn)分明,分離度佳;特征圖譜確立了雞骨草藥材的5個(gè)共有峰，雞骨草樣品相思子堿的平均含量為0.0235%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于雞骨草藥材與毛雞骨草藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)?！娟P(guān)鍵詞】雞骨草；毛雞骨草；高效液相色譜法；特征圖譜；相思子堿StudyonqualitystandardsoftheGuangdongSpecialherbAbruscantoniensisandconfusedherbAbrusmollis[Abstract]Objective:ToanalyzethequalitycontrolmethodsofAbruscantoniensisandconfusedherbAbrusmollis,andprovidedeffectivemethodsforevaluatingthequalityofAbruscantoniensisanddistinguishingtheauthenticityofAbruscantoniensisandconfusedherbAbrusmollis.Methods:Accordingtothegeneralmethodsofthe2020editionofChinesePharmacopoeia,qualitativeidentificationwasconductedbycharacteridentification,microscopiccharacteristicsandthinlayeridentification.HPLCcharacteristicchromatogramwasperformedonaAgilentrC18column(250mm×4.6mm,5μm)atroomtemperaturewithmethanol-5mmolpotassiumdihydrogenphosphateaqueoussolutionasthemobilephase.Flowratewas0.8mL?min-1.Detectionwavelengthwasat280nmand330nm.TheassaywasperformedinaXBridgeC18column(250mm×4.6mm,5μm)withamobilephaseofmethanol-water-phosphoricacid-triethylamine(12:88:0.36:0.16).Theflowratewas0.8mL?min-1,andthedetectingwavelengthwasat280nm.Results:Theestablishedmethodsforcharacteridentificationandmicroscopiccharacteristicswereaccurateandsimple,thespotswereclearandtheseparationwaswell.The5matualcharacteristicpeakswasdetectedforAbruscantoniensisbyHPLCcharacteristicchromatogram.TheaveragecontentofAbrineinAbruscantoniensissampleswas0.0031%.Conclusion:Thismethodissimpletooperate,theresultisstableandreliable,andcanbeusedfortheidentificationandqualityevaluationofAbruscantoniensisandconfusedherbAbrusmollis.[Keywords]AbruscantoniensisAbrusmollisHPLCHPLCcharacteristicchromatogramAbrine目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 12材料 22.1藥品 22.2試劑 22.3儀器 33實(shí)驗(yàn)與結(jié)果 43.1性狀鑒別 43.2顯微鑒別 53.3薄層色譜鑒別 63.4特征圖譜鑒別 83.4.1分析方法的建立 83.4.2雞骨草與毛雞骨草藥材的HPLC特征圖譜研究 103.5雞骨草藥材相思子堿含量測(cè)定 153.5.1分析方法的建立 153.5.2雞骨草藥材相思子堿含量測(cè)定 174討論 21參考文獻(xiàn) 22綜述 23致謝 32材料2.1藥品Y22201075、Y22201043、Y22201026、Y32201071雞骨草與Y22201076、Y22201044毛雞骨草全草干品,購(gòu)于廣東佛山中藥材專業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)國(guó)藥集團(tuán)馮了性（佛山）藥材飲片有限公司專業(yè)人員尹秋玲、張登斌鑒定，為豆科植物廣州相思子（AbruscantoniensisHance）的干燥全草與豆科植物毛相思子（AbrusmollisHance）的干燥不含豆莢的全草。雞骨草對(duì)照藥材，購(gòu)于樂(lè)美天醫(yī)藥德思特生物。2.2試劑表2-2實(shí)驗(yàn)試劑表名稱純度生產(chǎn)廠家相思子堿對(duì)照品(批號(hào):5891)-中科華檢（北京）科技有限公司水合氯醛-天津市百世化工有限公司稀甘油--甲醇分析純廣東光華科技股份有限公司正丁醇分析純廣東光華科技股份有限公司鹽酸分析純西隴科學(xué)股份有限公司氫氧化鈉-天津市百世化工有限公司薄層層析硅膠-青島海洋化工有限公司冰醋酸分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司純化水--水合茚三酮-天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司磷酸分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司三乙胺分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司三氯甲烷分析純西隴科學(xué)股份有限公司磷酸二氫鉀-廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心2.3儀器表2-3實(shí)驗(yàn)儀器表名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家生物顯微鏡CX41奧林巴斯株式會(huì)社超純水機(jī)Synergy廣州東銳科技有限公司數(shù)控超聲波清洗器KQ5200DV昆山市超聲儀器有限公司雙列八孔電熱恒溫水浴鍋DK-98-ⅡA天津市泰斯特儀器有限公司數(shù)控薄層色譜加熱器TH-Ⅱ上?？普苌萍加邢薰倦娮犹炱組E204TE/02梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司電熱恒溫干燥箱101-0廣州市康恒儀器有限公司電熱鼓風(fēng)干燥箱101-0A天津市泰斯特儀器有限公司薄層硅膠板-青島海洋化工有限公司電子天平FA2004B上海越平科學(xué)儀器有限公司電子天平MYA5.4Y深圳市怡華新電子有限公司玻璃儀器氣流烘干器-長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司密封型手提式中藥粉碎機(jī)100g浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠高效液相色譜儀LC-20A日本島津分析儀器有限公司高效液相色譜儀Agilent-1260安捷倫科技（中國(guó)有限公司）高效液相色譜儀RIGOLL-3000北京普源精電科技有限公司3實(shí)驗(yàn)與結(jié)果3.1性狀鑒別本論文通過(guò)看、聞、摸、嘗等方法，對(duì)雞骨草與毛雞骨草藥材的性狀(形態(tài)、大小、色澤、表面特征、質(zhì)地、氣味等)作為依據(jù)進(jìn)行鑒定。雞骨草的根大多為直徑約0.5-1.5cm的圓錐形，根部下細(xì)上粗，有小部分分枝；表面顯褐灰色，紋路縱向細(xì)小，質(zhì)硬粗糙，留有殘基；莖聚于一處，長(zhǎng)約50-100cm，直徑約0.2cm；褐灰色至棕紫色，長(zhǎng)有稀疏的短柔毛，細(xì)枝纖小。小葉約8-11對(duì)，長(zhǎng)約0.8-1.2cm，葉子為矩圓形羽狀復(fù)葉，大多脫落，每節(jié)莖上只生一片單葉，交互相間生于兩側(cè)；小葉下表面被有毛，先端平截面，有微小突尖。氣微香，味微苦。該批野生雞骨草莖偏紫褐色，家種雞骨草莖偏灰棕色。見(jiàn)圖1。babadcdc圖1雞骨草藥材（a、b：野生雞骨草；c、d：家種雞骨草）毛雞骨草根大多是長(zhǎng)細(xì)圓柱形，直徑約1-1.5mm，須根多，表面黃灰色到褐灰色；質(zhì)硬脆。根莖膨大呈瘤狀，上部有莖枝分生眾多；莖較粗大結(jié)實(shí)，長(zhǎng)約1-2m，直徑多約1-3mm，棕紫色至褐灰色；枝纖小，青黃色，長(zhǎng)柔毛密被。小葉長(zhǎng)約12-24mm，寬約4-6mm，葉子為長(zhǎng)矩圓形羽狀復(fù)葉，雙面密被長(zhǎng)柔毛。大多脫落，每節(jié)莖上只生一片單葉，交互相間生于兩側(cè)；先端平截面，有微小突尖，氣微香，味微苦。見(jiàn)圖2。圖2毛雞骨草藥材3.2顯微鑒別雞骨草粉末用水合氯醛2-3滴透明，滴加1滴稀甘油以后置于顯微鏡下觀察，粉末呈青灰色。有較多長(zhǎng)尖非腺毛單細(xì)胞分布，有疣狀突起，層紋明顯。長(zhǎng)度約60-970μm，直徑約12-22μm,壁厚約3-6μm,平軸式氣孔。有直徑約5-11μm的草酸鈣方晶，草酸鈣方晶在纖維束周圍形成晶纖維，細(xì)胞壁含晶處增厚不均勻。有直徑約16-40μm多顯呈類圓形和長(zhǎng)圓形的石細(xì)胞。木栓細(xì)胞呈褐黃色。見(jiàn)圖3。毛雞骨草粉末用水合氯醛透明滴加稀甘油以后在顯微鏡下觀察，粉末呈黃綠色至黃褐色。有較多非腺毛單細(xì)胞分布，頂端尖銳，長(zhǎng)度230-950μm區(qū)間，直徑6-12μm左右，壁較厚，有部分可見(jiàn)疣狀突起。葉表皮細(xì)胞呈不規(guī)則型，垂周壁波狀彎曲，氣孔為平軸式。纖維束周圍細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶鞘纖維，晶體細(xì)小，較少。木栓細(xì)胞呈黃棕色至紅棕色，類方形，壁增厚。見(jiàn)圖4。CBACBA。FEDFED圖3雞骨草粉末顯微特征圖注：A非腺毛單細(xì)胞；B氣孔；C晶纖維；D草酸鈣方晶；E石細(xì)胞；F木栓細(xì)胞HGHGIJIJ圖4毛雞骨草粉末顯微特征圖注：G非腺毛細(xì)胞；H葉表皮細(xì)胞及氣孔；I晶纖維；J木栓細(xì)胞3.3薄層色譜鑒別本論文取批號(hào)Y22201075、Y22201043、Y22201026、Y32201071雞骨草與批號(hào)Y22201076、Y22201044毛雞骨草粉末各（過(guò)二號(hào)篩）2g制備供試品溶液。圖3-3-1薄層色譜供試品制備流程圖制備對(duì)照品溶液。圖3-3-2薄層色譜對(duì)照品制備流程圖照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)。圖3-3-3薄層色譜點(diǎn)樣流程圖結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5雞骨草與毛雞骨草TLC圖譜注：1：相思子堿對(duì)照品；2：Y22201075雞骨草；3：Y22201043雞骨草；4：Y22201026雞骨草；5：Y32201071雞骨草；6：Y22201076毛雞骨草；7：Y22201044毛雞骨草為了優(yōu)選出最佳的展開(kāi)劑，由于正丁醇-醋酸-水（5:1:4）不分層，故曾嘗試用正丁醇-醋酸-水（3:1:6）的上層溶液為展開(kāi)劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)有拖尾，分析其原因可能是展開(kāi)劑偏中性，層析生物堿時(shí)易形成拖尾，而生物堿在硅膠色譜板上形成離子和游離的動(dòng)態(tài)平衡，也易形成拖尾。斑點(diǎn)的Rf值較小，表明展開(kāi)劑極性過(guò)小。分析其主要原因是雞骨草中相思子堿薄層鑒別主要用正丁醇萃取，所萃取的化學(xué)成分極性較大。根據(jù)相似相溶原理，極性大的成分易被吸附劑-硅膠吸附。當(dāng)展開(kāi)劑極性過(guò)小時(shí)，易造成斑點(diǎn)的斑點(diǎn)的Rf值較小，展開(kāi)效果不理想。見(jiàn)圖6。圖6雞骨草與毛雞骨草TLC圖譜注：1：相思子堿對(duì)照品；2：Y22201075雞骨草；3：Y22201043雞骨草；4：Y22201076毛雞骨草；5：Y22201044毛雞骨草由以上兩種不同極性大小的展開(kāi)劑展開(kāi)的結(jié)果分析，雞骨草與毛雞骨草相思子堿鑒別應(yīng)該選用的展開(kāi)劑的極性在正丁醇-醋酸-水（5:1:4）和正丁醇-醋酸-水（3:1:6）上層溶液的極性之間。故用正丁醇-醋酸-水（4:1:5）的上層溶液為展開(kāi)劑發(fā)現(xiàn)展開(kāi)效果較好，雞骨草供試品Rf值處于0.53~0.55，毛雞骨草供試品Rf值分別為0.54、0.57，斑點(diǎn)的Rf值適中，與相思子堿對(duì)照品Rf值0.58相似。故該批雞骨草藥材與毛雞骨草藥材中均含有相思子堿，且同類雞骨草藥材與毛雞骨草藥材各色譜斑點(diǎn)位置明顯不同，但該薄層鑒別雞骨草的方法無(wú)法明確分辨雞骨草與毛雞骨草藥材。3.4特征圖譜鑒別3.4.1分析方法的建立流動(dòng)相及洗脫方式的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇了不同類型梯度流動(dòng)相系統(tǒng)甲醇-5mmol磷酸二氫鉀水溶液進(jìn)行洗脫。見(jiàn)表1，2。預(yù)試驗(yàn)中選擇了a、b兩種不同的流動(dòng)相，在確定的洗脫程序下進(jìn)行不同類型梯度洗脫。在不同類型梯度洗脫下，各色譜峰的分離度可能會(huì)有所不同，最終導(dǎo)致色譜圖的不同。優(yōu)選流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)應(yīng)該優(yōu)選分離度較好，峰型拖尾較少的流動(dòng)相系統(tǒng)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相系統(tǒng)a所得的色譜圖，混合對(duì)照品色譜峰難以分離。選用流動(dòng)相系統(tǒng)b所得的色譜圖，混合對(duì)照品色譜峰能較好分離，分析原因分子在不同濃度的溶劑環(huán)境中具有不同溶解度，溶解度在溶劑中不同的物質(zhì)就溶劑組成的不斷變化的濃度環(huán)境下分離出來(lái)，梯度洗脫能使相思子堿和刺桐堿在較合適的溶劑濃度下洗脫分離。故選定流動(dòng)相系統(tǒng)b為最佳的流動(dòng)相系統(tǒng)。各色譜峰分離度較好，峰型較好，拖尾較少，保留時(shí)間適中。不同類型梯度洗脫雞骨草預(yù)實(shí)驗(yàn)的HPLC色譜圖見(jiàn)圖7。表1流動(dòng)相系統(tǒng)=1\*alphabetica等度洗脫時(shí)間（min）甲醇（％）5mmol/L磷酸二氫鉀水溶液（％）0-10298表2流動(dòng)相系統(tǒng)b梯度洗脫時(shí)間（min）甲醇（％）5mmol/L磷酸二氫鉀水溶液（％）0～105～1095～9010～2010～2590～7520～3025～3075～7030～4030～4070～60605050圖7不同流動(dòng)相系統(tǒng)下相思子堿、刺桐堿混合對(duì)照品色譜圖3.4.2雞骨草與毛雞骨草藥材的HPLC特征圖譜研究色譜條件Agilent-1260高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國(guó)有限公司））；AgilentC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相系統(tǒng)b梯度洗脫；體積流量0.8ml/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)0～15min（280nm），15～40min（330nm）；進(jìn)樣量5μＬ。對(duì)照品溶液的制備圖3-4-2-2相思子堿、刺桐堿混合對(duì)照品溶液制備流程圖對(duì)照藥材溶液的制備圖3-4-2-3雞骨草對(duì)照藥材溶液制備流程圖供試品溶液的制備圖3-4-2-4雞骨草與毛雞骨草供試品溶液制備流程圖方法學(xué)考察.1精密度試驗(yàn)取雞骨草藥材（批號(hào)Y22201075）適量，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定5次，以峰1作為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均分別不高于3.0％，表明儀器精密度良好。.2重復(fù)性試驗(yàn)取雞骨草藥材（批號(hào)Y22201075）適量，平行5份，制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定以1號(hào)峰為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均不高于3.0％，表明該方法重復(fù)性良好。.3專屬性試驗(yàn)取雞骨草供試品（批號(hào)Y22201075）和對(duì)照品溶液適量，測(cè)得兩者在相應(yīng)保留時(shí)間處有相同色譜峰，表明該方法專屬性良好。.4圖譜生成精密稱取批號(hào)為Y22201075、Y22201043、Y22201026、Y32201071雞骨草樣品，制備供試品溶液，通過(guò)結(jié)果進(jìn)行分析，見(jiàn)圖8，選擇重復(fù)性、分離度較好的5個(gè)色譜峰作為雞骨草共有峰，由于它們分布較分散，故以保留時(shí)間適中、出峰穩(wěn)定、有對(duì)照品的1號(hào)峰（相思子堿）為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03～0.31，相對(duì)保留峰面積RSD為28.48～118.96。截至目前，在特征圖譜定性研究過(guò)程中是以相似度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，但由于檢測(cè)中心“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”的不完善，故本論文采用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)各共有峰進(jìn)行控制，雞骨草藥材色譜中應(yīng)呈現(xiàn)5個(gè)特征峰，其中峰1、2分別應(yīng)與相思子堿、刺桐堿對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)；與相思子堿參照物峰相對(duì)應(yīng)的峰為S峰，2、3、4、5號(hào)峰與其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±10％范圍之內(nèi)，分別為2.11（2號(hào)峰）、2.52（3號(hào)峰）、3.80（4號(hào)峰）、4.12（5號(hào)峰）。.5雞骨草、毛雞骨草特征圖譜比較圖8顯示，批號(hào)為Y22201075、Y22201043、Y22201026、Y32201071雞骨草特征圖譜具有與對(duì)照藥材相同的5個(gè)特征峰，各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間均落在規(guī)定范圍內(nèi)，其中峰1、2分別應(yīng)與相思子堿、刺桐堿對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)。表明兩者化學(xué)成分無(wú)明顯變化，具有一定的等效性與相關(guān)性，可鑒定為雞骨草藥材。圖9顯示，批號(hào)Y22201076、Y22201044毛雞骨草特征圖譜與雞骨草對(duì)照藥材特征圖譜對(duì)比，毛雞骨草特征圖譜中均呈現(xiàn)與相思子堿參照物峰相對(duì)應(yīng)的峰和與雞骨草對(duì)照藥材特征圖譜峰3對(duì)應(yīng)，其中Y22201044毛雞骨草峰1、2分別與相思子堿、刺桐堿對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)，但毛雞骨草特征圖譜中呈現(xiàn)的峰6、7，在雞骨草對(duì)照藥材特征圖譜均未呈現(xiàn)，表明兩者化學(xué)成分有一定的變化，具有部分相關(guān)性和差異性，且整體與雞骨草對(duì)照藥材特征圖譜相似度不高，故可鑒定為混淆品雞骨草藥材。圖8不同批次雞骨草藥材共有峰色譜圖圖9不同批次毛雞骨草藥材特征圖譜3.5雞骨草藥材相思子堿含量測(cè)定3.5.1分析方法的建立供試品提取方法及洗脫方式的考察優(yōu)化①取適量Y22201026雞骨草藥材，粉碎，過(guò)藥典三號(hào)篩。圖3-5-1-1-1雞骨草供試品溶液制備流程圖②取適量Y22201026雞骨草藥材，粉碎，過(guò)藥典三號(hào)篩。圖3-5-1-1-2雞骨草供試品溶液制備流程圖從雞骨草藥材中提取相思子堿在提取工藝中未經(jīng)過(guò)除雜處理，所含的雜質(zhì)較多，并且用三氯甲烷作為溶劑進(jìn)行預(yù)處理，可避免雜質(zhì)干擾柱效、保護(hù)色譜柱，其中最主要的干擾物質(zhì)是葉綠素，雞骨草是藤本植物干燥全株，富含大量葉綠素，葉綠素可被色譜柱吸附形成死吸附，HPLC必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)某s處理才能進(jìn)樣，該法預(yù)處理后，不僅不影響待測(cè)成分相思子堿的提取，還能除去大部分葉綠素。在同一色譜條件不同流速下進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取方法②相較提取方法①雜峰較少，相思子堿峰分離度較好，峰形較好，峰面積變大，提取含量較高。分析原因是樣品除雜時(shí)間與提取時(shí)間變長(zhǎng)，洗脫流速變慢，除雜與提取效果較充分，吸附檢測(cè)更契合。所以得到的色譜圖較好。因此選用提取方法②作為雞骨草藥材相思子堿含量測(cè)定最佳的提取工藝。同一色譜條件調(diào)整流速后測(cè)定雞骨草中相思子堿含量。結(jié)果見(jiàn)圖10。WVL：280nm②三氯甲烷除雜2h，甲醇提取2hWVL：280nm②三氯甲烷除雜2h，甲醇提取2hWVL：280nm②三氯甲烷除雜6h，甲醇提取4hWVL：280nm②三氯甲烷除雜6h，甲醇提取4h圖10雞骨草中相思子堿提取方法的選擇流動(dòng)相的選擇優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇了兩種流動(dòng)相系統(tǒng)甲醇-水(12:88)、甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16)等度洗脫。實(shí)驗(yàn)中選擇了甲醇-水(12:88)、甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16)兩種不同的流動(dòng)相系統(tǒng)。主要區(qū)別在于是否加入磷酸和三乙胺，因?yàn)橄嗨甲訅A的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有酸性和堿性基團(tuán)，加入一定比例磷酸和三乙胺可有效改善峰形。比較兩者不同流動(dòng)相系統(tǒng)在相同的色譜條件下所得的色譜圖發(fā)現(xiàn)，甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16)相較甲醇-水(12:88)，整體峰形較好，色譜峰分離度較好，保留時(shí)間適中。所以選定甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16)為最佳的流動(dòng)相系統(tǒng)。不同流動(dòng)相雞骨草藥材含量測(cè)定的HPLC色譜圖見(jiàn)圖11。流動(dòng)相：甲醇-水(12:88)流動(dòng)相：甲醇-水(12:88)流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16)流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16)圖11不同流動(dòng)相系統(tǒng)下Y22201026雞骨草含量測(cè)定色譜圖3.5.2雞骨草藥材相思子堿含量測(cè)定色譜條件LC-20A高效液相色譜儀（日本島津分析儀器有限公司）；色譜柱：XBridgeC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸-三乙胺(12:88:0.36:0.16)；流速0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品溶液的制備圖3-5-2-2相思子堿對(duì)照品溶液制備流程圖供試品溶液的制備取適量Y22201075、Y22201043、Y22201026、Y32201071雞骨草藥材，粉碎，過(guò)藥典3號(hào)篩。圖3-5-2-3雞骨草供試品溶液制備流程圖方法學(xué)考察.1線性關(guān)系考察精密稱取相思子堿對(duì)照品適量,加80%甲醇制成毎1mL含0.1mg的溶液。精密吸取該溶液2、4、6、8、10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為：Y=20439.7*x+0r=0.9999(n=4)結(jié)果表明相思子堿進(jìn)樣量在0.2～1μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。.2精密度實(shí)驗(yàn)取0.1mg/mL相思子堿對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6次，RSD為1.44%，結(jié)果表明儀器精密度良好。.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取Y32201071雞骨草樣品6份，制備6份平行供試品溶液，測(cè)定平均含量為0.0031%，RSD為0.087%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。.4加樣回收率試驗(yàn)取Y22201043雞骨草樣品6份，每份精密稱定約1.0g，分別精密加入相思子堿對(duì)照品0.5775mg、0.5790mg、0.5792mg、0.5811mg、0.5813mg、0.5895mg。制備6份所需溶液，測(cè)定計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.39%（n=6）..4樣品含量測(cè)定取Y22201075、Y22201043、Y22201026、Y32201071雞骨草樣品，制備供試品溶液，進(jìn)行進(jìn)樣分析，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算相思子堿含量，結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖12。表3樣品測(cè)定結(jié)果序號(hào)（No.）批號(hào)含量（%）1Y222010750.00592Y222010430.0683Y222010260.0164Y322010710.0031Y32201043Y32201043雞骨草HPLC色譜圖Y32201071雞骨草HPLC色譜圖Y32201071雞骨草HPLC色譜圖圖12對(duì)照品相思子堿和廣東佛山中藥材市場(chǎng)4批雞骨草藥材HPLC色譜圖4討論本論文建立雞骨草與毛雞骨草藥材的性狀、顯微、薄層圖譜、特征圖譜鑒別方法以及雞骨草藥材的含量測(cè)定，測(cè)定4個(gè)不同批次雞骨草樣品和2個(gè)不同批次的毛雞骨草樣品的性狀、顯微、薄層、特征圖譜進(jìn)行對(duì)比鑒定，用于分析評(píng)價(jià)不同批次雞骨草與毛雞骨草樣品在鑒別結(jié)果中體現(xiàn)的差異性，從而評(píng)價(jià)雞骨草與毛雞骨草樣品的質(zhì)量。重點(diǎn)解決了雞骨草與毛雞骨草的HPLC色譜特征圖譜試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件的考察優(yōu)選、確立了合適的檢測(cè)方法,并且進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，對(duì)完善雞骨草與毛雞骨草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。雞骨草與毛雞骨草藥材的性狀、顯微、薄層圖譜在同樣的鑒定方法條件下，通過(guò)性狀鑒別，可觀察到該批雞骨草與毛雞骨草藥材根部顏色差異較明顯，毛雞骨草根狀莖形態(tài)方面膨大呈瘤狀；顯著差異在于小葉，雞骨草小葉為矩圓形，大多為褐灰色，下表面被有毛；毛雞骨草小葉為長(zhǎng)矩圓形，多為青黃色，雙面密被長(zhǎng)柔毛。通過(guò)顯微鑒別，可觀察到該批雞骨草與毛雞骨草藥材的粉末顏色差異較明顯，雞骨草粉末為青灰色，毛雞骨草粉末為黃綠色，顯微特征差異在于石細(xì)胞和草酸鈣方晶，毛雞骨草粉末顯微較雞骨草粉末顯微未發(fā)現(xiàn)有石細(xì)胞，游離的草酸鈣方晶及少。通過(guò)薄層圖譜鑒別，可觀察到該批雞骨草與毛雞骨草均含有相思子堿，且雞骨草與毛雞骨草同類各斑點(diǎn)相似度高。通過(guò)以上研究，在確定藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)也對(duì)雞骨草與毛雞骨草進(jìn)行了鑒別。通過(guò)HPLC特征圖譜，確定了雞骨草藥材的5個(gè)共有峰，利用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)每個(gè)共有峰進(jìn)行范圍規(guī)定，可從整體上反映不同批次雞骨草質(zhì)量，也可與混淆品毛雞骨草藥材進(jìn)行對(duì)比鑒定。根據(jù)以上4批雞骨草藥材測(cè)定結(jié)果可看出，該批雞骨草藥材相思子堿含量較低，不同批次的雞骨草藥材中相思子堿含量存在差異，可能與其產(chǎn)地、采收時(shí)間、加工、儲(chǔ)存等因素有關(guān)。因此，在應(yīng)用相關(guān)藥方臨床和生產(chǎn)相關(guān)的中成藥制劑產(chǎn)品時(shí)，要注重藥材的來(lái)源，以保證相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量的有效性與穩(wěn)定性。為了更深入地研究雞骨草藥材與毛雞骨草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)比鑒定，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)中還選用雞骨草與毛雞骨草對(duì)照藥材對(duì)兩者的薄層色譜鑒別進(jìn)行比較鑒定以及對(duì)混淆品毛雞骨草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步研究。遺憾的是由于實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備和時(shí)間關(guān)系，未能完成相關(guān)研究。參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:四部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020:203.[2]肖曉，姚香草，余亞茹，等.雞骨草的資源調(diào)查與生藥學(xué)鑒定[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2019，37（04）：318-321.[3]