離子交換層析

關(guān)于離子交換層析

1848年，Thompson

等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。

第2頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)基本原理

在水中呈不溶解狀態(tài)，能釋放出反離子。同時(shí)它與溶液中的其他離子或離子化合物相互結(jié)合，結(jié)合后不改變本身和被結(jié)合離子或離子化合物的理化性質(zhì)。離子交換劑特性第3頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要是以離子交換方式進(jìn)行。所進(jìn)行的離子交換反應(yīng)是可逆的。假定以RA代表陽離子交換劑，在溶液中解離出來的陽離子A+與溶液中的陽離子B+可發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：

RA+B+

→RB+A+該反應(yīng)能以極快的速率達(dá)到平衡，平衡的移動遵循質(zhì)量作用定律。離子交換反應(yīng)第4頁,共66頁，2024年2月25日，星期天示意圖（離子交換過程）電離基團(tuán)（磺酸根）可交換離子（鈉離子）交換離子不交換離子第5頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，結(jié)合力的大小取決于離子交換劑的選擇性。離子交換劑的選擇性可用其反應(yīng)的平衡常數(shù)K表示：

K＝[RB][A+]/[RA][B+]如果反應(yīng)溶液中[A+]等于[B+]，則K＝[RB]/[RA]。若K>1，即[RB]>[RA]，表示離子交換劑對B+的結(jié)合力大于A+

；若K=1，即[RB]＝[RA]，表示離子交換劑對A+

和B+的結(jié)合力相同；若K<1，即[RB]<[RA]，表示離子交換劑對B+的結(jié)合力小于A+。

K值是反映離子交換劑對不同離子的結(jié)合力或選擇性參數(shù)，故稱K值為離子交換劑對A+和B+的選擇系數(shù)。第6頁,共66頁，2024年2月25日，星期天影響離子交換選擇性的因素水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；離子化合價(jià)：高價(jià)離子易于被吸附；溶液pH：影響交換基團(tuán)和交換離子的解離程度，不但影響交換容量；對交換選擇性影響亦大。離子強(qiáng)度：越低越好；有機(jī)溶劑：不利于吸附；交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯(lián)度小，膨脹度大，吸附量減少；樹脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；如Na+<Ca2+<Al3＋<Si4＋。如原子價(jià)數(shù)相同，交換量則隨交換離子的原子序數(shù)的增加而增大，如Li＋

<Na＋<K＋<Pb＋。在稀溶液中適用。

在稀溶液中，強(qiáng)堿性樹脂的各負(fù)電性基團(tuán)的離子結(jié)合力次序是：CH3COO–<F–<OH–<HCOO–<Cl–<Br–<CrO42–<NO2–<I–<C2O42–<SO42–<檸檬酸根。弱堿性陰離子交換樹脂對各負(fù)電性基團(tuán)結(jié)合力的次序?yàn)椋篎–<C1–<Br–=I–＝CH3COO–<MoO42–<PO43–<AsO43–<NO3–<酒石酸根<檸檬酸根<CrO42–<SO42–<OH–。1、競爭；2、增加蛋白質(zhì)的水合作用，降低吸附和交換速度。第7頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

兩性離子如蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸等與離子交換劑的結(jié)合力，主要決定于它們的理化性質(zhì)和特定的條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH<pI時(shí)，能被陽離子交換劑吸附，反之，當(dāng)pH>pI時(shí)，能被陰離子交換劑吸附。若在相同pI條件下，且pI>pH時(shí)，pI越高，堿性越強(qiáng)，就越容易被陽離子交換劑吸附。離子交換層析就是利用離子交換劑的荷電基團(tuán)，吸附溶液中相反電荷的離子或離子化合物，被吸附的物質(zhì)隨后為帶同類型電荷的其他離子所置換而被洗脫。由于各種離子或離子化合物對交換劑的結(jié)合力不同，因而洗脫的速率有快有慢，形成了層析層。第8頁,共66頁，2024年2月25日，星期天離子交換機(jī)理A+自溶液中擴(kuò)散到樹脂表面A+從樹脂表面進(jìn)入樹脂內(nèi)部的活性中心A+與RB在活性中心上發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)解吸附離子B+自樹脂內(nèi)部擴(kuò)散至樹脂表面B+離子從樹脂表面擴(kuò)散到溶液中交換速度的控制步驟是擴(kuò)散速度，不同的分離體系可能由內(nèi)部擴(kuò)散或外部擴(kuò)散控制第9頁,共66頁，2024年2月25日，星期天影響交換速度的因素顆粒大?。河≡娇旖宦?lián)度：交聯(lián)度小，交換速度快溫度：越高越快,與擴(kuò)散系數(shù)增加有關(guān)離子化合價(jià)：化合價(jià)越高，擴(kuò)散速度小離子大?。涸叫≡娇鞌嚢杷俣龋涸谝欢ǔ潭壬?，越大越快溶液濃度：當(dāng)交換速度為外擴(kuò)散控制時(shí)，濃度越大，交換速度越快第10頁,共66頁，2024年2月25日，星期天離子交換層析的基本原理

若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的牢固程度有差異，選用適當(dāng)?shù)南疵撘嚎蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。++++++———++++++++++第11頁,共66頁，2024年2月25日，星期天1.平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2.吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、4.解吸附階段：梯度緩沖溶液先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)5.再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分洗滌，既可重復(fù)使用第12頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)離子交換劑的分類及性質(zhì)

一、離子交換劑的類型

根據(jù)離子交換劑中基質(zhì)的組成及性質(zhì)，可將其分成兩大類：疏水性離子交換劑和親水性離子交換劑。

(1)疏水性離子交換劑

是一種與水親和力較小的人工合成樹脂，最常見的是由苯乙烯與交聯(lián)劑二乙烯苯反應(yīng)生成的聚合物，在此結(jié)構(gòu)中再以共價(jià)鍵引入不同的電荷基團(tuán)。由于引入電荷基團(tuán)的性質(zhì)不同，又可分為陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂及螯合離子交換樹脂。第13頁,共66頁，2024年2月25日，星期天①陽離子交換劑：

陽離子交換劑的電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電，可與溶液中的陽離子或帶正電荷化合物進(jìn)行交換反應(yīng)。

依據(jù)電荷基團(tuán)的強(qiáng)弱，可分為強(qiáng)酸型(帶磺酸的基團(tuán)，R－SO3H)、中強(qiáng)酸型（含磷酸基團(tuán)或亞磷酸基團(tuán)，R－PO3H2）及弱酸型（帶羧基和酚基的樹脂，R－COOH或R－苯環(huán)－OH）三種。這些交換劑在交換時(shí)，氫離子為外來的陽離子所取代，如下式所示：

R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+第14頁,共66頁，2024年2月25日，星期天②陰離子交換劑

此類交換劑是在基質(zhì)骨架上引入季胺[-N

(CH3)3]、叔胺[-N(CH3)2]、仲胺[-NHCH3]和伯胺[-NH2]基團(tuán)后構(gòu)成的。

依據(jù)胺基堿性的強(qiáng)弱，又可分為強(qiáng)堿性(含季胺基)、弱堿性(含叔胺、仲胺基)及中強(qiáng)堿性(既含強(qiáng)堿性基團(tuán)又含弱堿性基團(tuán))三種陰離子交換劑。

它們與溶液中的離子進(jìn)行交換時(shí)，反應(yīng)式為：第15頁,共66頁，2024年2月25日，星期天③螯合離子交換劑：

這類離子交換樹脂具有吸附(或絡(luò)合)一些金屬離子而排斥另一些離子的能力，可通過改變?nèi)芤旱乃岫忍岣咂溥x擇性。由于它的高選擇性，只需用很短的樹脂柱就可以把欲測的金屬離子濃縮并洗脫下來。疏水性離子交換劑含有大量的活性基團(tuán)，交換容量大、流速快、機(jī)械強(qiáng)度大，主要用于分離無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸及氨基酸等小分子物質(zhì)，也可用于從蛋白質(zhì)溶液中除去表面活性劑(如SDS)、去污劑(如TritonX—100)、尿素、兩性電解質(zhì)等。第16頁,共66頁，2024年2月25日，星期天(2)親水性離子交換劑

與水親和性較大，有纖維素、交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等。

①纖維素離子交換劑

又稱離子交換纖維素，是以微晶纖維素為基質(zhì)，引入電荷基團(tuán)構(gòu)成的。分為強(qiáng)酸性、弱酸性、強(qiáng)堿性及弱堿性離子交換劑。纖維素離子交換劑中，最廣泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE一)纖維素和羧甲基(CM一)纖維素。

近年來Pharmacia公司用微晶纖維素經(jīng)交聯(lián)作用，制成了類似凝膠的珠狀弱堿性離子交換劑(DEAE—Sephacel)，結(jié)構(gòu)與DEAE一纖維素相同，對蛋白質(zhì)、核酸、激素及其他生物聚合物都有同等的分辨率。

第17頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

微晶纖維-又稱纖維素膠或結(jié)晶纖維素

性狀：白色或幾乎白色的細(xì)小粉末，無臭，無味，可壓成自身粘合的小片，并可在水中迅速分散，不溶于水、稀酸、稀堿溶液和大多數(shù)有機(jī)溶劑。

制法：將纖維性植物材料與無機(jī)酸搗成漿狀，經(jīng)處理使之降解后漂洗、研磨、脫水、烘干、粉碎制成。第18頁,共66頁，2024年2月25日，星期天目前常用的纖維素交換劑第19頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

離子交換纖維素適用于分離大分子多價(jià)電解質(zhì)。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)疏松，對生物高分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)和核酸分子)有較大的穿透性；

表面積大，因而有較大的吸附容量；

基質(zhì)是親水性的，避免了疏水性反應(yīng)對蛋白質(zhì)分離的干擾；電荷密度較低，與蛋白質(zhì)分子結(jié)合不牢固，在溫和洗脫條件下即可達(dá)到分離的目的，不會引起蛋白質(zhì)的變性。但纖維素分子中只有一小部分羥基被取代，結(jié)合在其分子上的解離基團(tuán)數(shù)量不多，故交換容量小，僅為交換樹脂的1/10左右。第20頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

②交聯(lián)葡聚糖離子交換劑

交聯(lián)葡聚糖離子交換劑是以交聯(lián)葡聚糖G–25和G–50為基質(zhì)，通過化學(xué)方法引入電荷基團(tuán)而制成的。

交換劑G–50型適用于相對分子質(zhì)量為3×104～3×106的物質(zhì)的分離，交換劑G–25型能交換相對分子質(zhì)量較小(1×103～5×103)的蛋白質(zhì)。

交聯(lián)葡聚糖離子交換劑的性質(zhì)與葡聚糖凝膠相似，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中不穩(wěn)定，在pH＝7時(shí)可耐120℃的高熱。它既有離子交換作用，又有分子篩性質(zhì)，可根據(jù)分子大小對生物高分子物質(zhì)進(jìn)行分級分離，但不適用于分級分離相對分子質(zhì)量大于2×105的蛋白質(zhì)。第21頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

③瓊脂糖離子交換劑

主要以交聯(lián)瓊脂糖CL–6B為基質(zhì)，引入電荷基團(tuán)而構(gòu)成。這種離子交換凝膠對pH及溫度的變化均較穩(wěn)定，可在pH3～10和0～70℃范圍內(nèi)使用，改變離子強(qiáng)度或pH時(shí)，床體積變化不大。如DEAE–SepharoseCL–6B為陰離子交換劑；CM–SepharoseCL–6B為陽離子交換劑,它們的外形呈珠狀，網(wǎng)孔大，特別適用于相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)和核酸等化合物的分離，即使加快流速，也不影響分辨率。第22頁,共66頁，2024年2月25日，星期天按骨架結(jié)構(gòu)不同，離子交換樹脂可分為：

凝膠型和大孔型。苯乙烯或丙烯酸與交聯(lián)劑二乙烯苯聚合而成，透明，沒有毛細(xì)孔，吸水后形成微細(xì)的孔隙，適合交換無離子等小分子。苯乙烯或丙烯酸與交聯(lián)劑二乙烯苯的異構(gòu)體聚合，經(jīng)過特殊的物理處理，行成大網(wǎng)孔，再導(dǎo)入交換基團(tuán)制成，不透明，既有微孔又有大粗孔，吸附大分子，耐污染。第23頁,共66頁，2024年2月25日，星期天疏水性離子交換劑（樹脂）的命名

（D）①②③×④（D）——大孔型無——凝膠型①分類代號0—強(qiáng)酸1—弱酸3—弱堿4—螯合5—兩性6—氧化還原活性基團(tuán)②骨架名稱0—苯乙烯系1—丙烯酸系2—酚醛系3—環(huán)氧系4—乙烯吡啶系5—脲醛系6—氯乙烯系③順序代號用以區(qū)別交換基團(tuán)或交聯(lián)劑的差異。④交聯(lián)度（%）第24頁,共66頁，2024年2月25日，星期天例：

001×7

凝膠型苯乙烯系強(qiáng)酸陽離子交換樹脂交聯(lián)度為7%

D001

大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂

第25頁,共66頁，2024年2月25日，星期天親水性離子交換劑的命名交換基團(tuán)寫在前面，然后寫骨架，最后寫原骨架的編號。在編號前加C、A以區(qū)分陽離子和陰離子。如：DEAE-SephadexA-25CM-SephadexC-25

第26頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、性質(zhì)

1、顏色與形狀

樹脂類離子交換劑：褐色、黃色、乳白色等親水性離子交換劑：白色珠狀

2、交聯(lián)度交聯(lián)度：交聯(lián)劑在離子交換劑中的比例，用重量百分率表示。第27頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

3、膨脹度（吸水量）膨脹度：每g干膠在水或其他規(guī)定的溶劑中，在一定時(shí)間與溫度條件下膨脹后所占有的體積毫升數(shù)。

影響膨脹度的因素有：

（1）、基質(zhì)（2）、電荷基團(tuán)（3）、離子強(qiáng)度和pH值

親水性離子交換劑大，疏水性離子交換劑小。與交聯(lián)度的關(guān)系。強(qiáng)堿和強(qiáng)酸大于弱堿和弱酸；電荷數(shù)和性質(zhì)相同，相差不大。交聯(lián)度大的離子交換劑對離子強(qiáng)度和pH值不敏感。交聯(lián)度小或者弱的離子交換劑相反。第28頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

4.交換容量

交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量，它反映離子交換劑與溶液中離子進(jìn)行交換的能力。通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團(tuán)的毫克當(dāng)量數(shù)（meq/mg或meq/ml）表示?？偨粨Q容量：理論交換容量，它只和離子交換劑本身的性質(zhì)有關(guān)。有效交換容量：實(shí)際交換容量，與實(shí)驗(yàn)條件有很大的關(guān)系，后面提到的交換容量如未經(jīng)說明都是指有效交換容量。第29頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

影響交換容量的因素：

1、篩孔要根據(jù)被分離的對象來選擇。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大，交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應(yīng)盡量能夠讓樣品組分進(jìn)入，這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品，可以選擇較小孔隙的交換劑，因?yàn)樾》肿涌梢宰杂傻倪M(jìn)入孔隙，而小孔隙離子交換劑的表面積大于大孔隙的離子交換劑。第30頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

2、離子強(qiáng)度

一般來說，離子強(qiáng)度增大，交換容量下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要降低交換容量以將結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。

3、pH值首先pH值影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。其次影響離子交換劑的解離程度。pH對弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，弱酸型離子交換劑在pH較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量小。第31頁,共66頁，2024年2月25日，星期天交換容量的測定法（1）強(qiáng)酸型陽離子交換介質(zhì)交換容量的測定法

取一定量的離子交換介質(zhì)，去離子水溶脹，漂洗干凈用1mol／L的NaOH處理，去離子水洗至中性，1mol／L的HCl處理，去離子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脫，收集洗脫液，再通過已標(biāo)定的NaOH滴定洗脫液中的氫離子濃度，計(jì)算出吸附氫離子的毫摩爾數(shù)量，除以離子交換介質(zhì)的質(zhì)量，即可得到交換容量。第32頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）強(qiáng)堿型陰離子交換介質(zhì)交換容量的測定方法

取一定量的離子交換介質(zhì)，去離子水溶脹，漂洗干凈，用1mol／L的HCl處理，去離子水洗至中性，1mol／L的NaOH處理，去離子水洗至中性。然后用1mol／L的NaCl洗脫，收集洗脫液，再通過已標(biāo)定的HCl滴定洗脫液中的氫氧根離子濃度，計(jì)算出吸附氫氧根離子的毫摩爾數(shù)量，除以離子交換介質(zhì)的質(zhì)量即可得到交換容量。第33頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（3）凝膠或纖維類弱堿性或弱酸性離子交換介質(zhì)

換容量的測定方法

取一定量的離子交換介質(zhì)，漂洗干凈，用1mol／L的NaCl處理，去離子水洗至中性，緩沖液平衡，用已知蛋白的濃度樣品過柱吸附，直至柱內(nèi)的介質(zhì)吸附的量達(dá)到飽和。用一定濃度的NaCl或其他的洗脫劑洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中的蛋白質(zhì)的濃度，按計(jì)算公式計(jì)算交換容量。第34頁,共66頁，2024年2月25日，星期天5．其它穩(wěn)定性，離子交換劑穩(wěn)定性都較好，特別是樹脂類離子交換劑，在濃度較高的酸或堿溶液中進(jìn)行短期處理后，其性質(zhì)仍無改變。而親水性離子交換劑的理化穩(wěn)定性一般與其基質(zhì)的穩(wěn)定性相近。與樹脂類相比，穩(wěn)定性差，易被污染。比重，離子交換劑經(jīng)過溶脹處理后的比重是恒定的。不同的溶液中溶脹處理后的比重是有差異。流速，一般是由離子交換劑的性質(zhì)、操作壓、層析柱體積和分離樣品的要求等因子控制的。在操作壓和其它層析條件相同的情況下，離子交換劑的顆粒大，洗脫液的黏度小，流速就快，反之流速則慢。第35頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)離子交換劑與緩沖液的選擇

一、離子交換劑的選擇

應(yīng)用離子交換層析技術(shù)分離物質(zhì)時(shí)，選擇理想的離子交換劑是提高獲得率和分辨率的重要環(huán)節(jié)。任何一種離子交換劑都不可能適用于所有的樣品物質(zhì)的分離，因此必須根據(jù)各類離子交換劑的性質(zhì)以及待分離物質(zhì)的理化性質(zhì)，選擇一種最理想的離子交換劑進(jìn)行層析分離。第36頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

選擇離子交換劑的一般原則如下：

(1)陰、陽離子交換劑選擇

如果被分離物質(zhì)帶正電荷，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電荷，應(yīng)選擇陰離子交換劑；如被分離物為兩性離子，則一般應(yīng)根據(jù)其在穩(wěn)定pH范圍內(nèi)所帶電荷的性質(zhì)來選擇交換劑的種類。

(2)強(qiáng)、弱離子交換劑選擇

強(qiáng)型離子交換劑適用的pH范圍很廣，常用來制備去離子水和分離一些在極端pH溶液中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)。弱型離子交換劑適用pH范圍狹窄，在pH為中性的溶液中交換容量高，用它分離生命大分子物質(zhì)時(shí)，其活性不易喪失。

第37頁,共66頁，2024年2月25日，星期天(3)不同離子型交換劑的選擇

離子交換劑處于電中性時(shí)常帶有一定的反離子，使用時(shí)選擇何種離子交換劑，取決于交換劑對各種反離子的結(jié)合力。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。據(jù)此，強(qiáng)酸型和強(qiáng)堿型離子交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型；弱酸型和弱堿型交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。

另外還要保證平衡離子不對樣品組分有明顯影響。因?yàn)樵诜蛛x過程中，平衡離子被置換到流動相中，它不能對樣品組分有污染或破壞。如在制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因?yàn)槠渌x子都會對純水有污染。但是在分離蛋白質(zhì)時(shí)，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因?yàn)榉蛛x過程中H或OH離子被置換出來都會改變層析柱內(nèi)pH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質(zhì)的變性。

第38頁,共66頁，2024年2月25日，星期天(4)不同基質(zhì)離子交換劑的選擇

交換劑的基質(zhì)是疏水性還是親水性，對被分離物質(zhì)的穩(wěn)定性和分離效果均有影響。一般認(rèn)為，在分離生命大分子物質(zhì)時(shí)，選用親水性基質(zhì)的交換劑較為合適，它們對被分離物質(zhì)的吸附和洗脫都比較溫和，活性不易破壞。第39頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、緩沖液的選擇

離子交換劑不僅要與被分離的物質(zhì)交換,還要求與緩沖液進(jìn)行交換。選用的起始緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度等要么能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，而不能使樣品中雜質(zhì)與離子交換劑結(jié)合，pH值一般比有效成分的pI值高一個(gè)單位或低一個(gè)單位，就能把有效成分和雜質(zhì)分開?；蛘哌x擇緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值，使雜質(zhì)和離子交換劑結(jié)合牢固，有效成分和離子交換劑結(jié)合不牢。

洗脫液的選擇主要是使和離子交換結(jié)合的成分解離下來。離子強(qiáng)度比起始緩沖液高。

緩沖液的選擇關(guān)鍵在于有效成分的等電點(diǎn)。對于一種提取分離的未知有效成分而言，其等電點(diǎn)須通過試驗(yàn)才能確定。選擇緩沖液的方法(見P89)

MoNoQ:陰離子交換層析,顆粒直徑10um,載量65mgBSA/mlMoNoS:陽離子交換層析第40頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、加樣量的確定

層析時(shí)加樣量的多少除與離子交換劑的總交換容量大小關(guān)系密切外，還與樣品中有效成分的吸附性能以及有效成分與雜質(zhì)之間的比例等因子有關(guān)。第43頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)操作

一、交換劑的預(yù)處理、再生和轉(zhuǎn)型

商品離子交換樹脂為干樹脂，因含有一些水不溶性雜質(zhì)，所以要處理，一般程序如下：干樹脂加過量的水除去細(xì)顆粒，再用水浸泡2小時(shí)后減壓抽去氣泡，傾去水，再用大量去離子水洗至澄清，去水后加4倍量的2mol/LHCl溶液，攪拌4小時(shí)，除去酸液，用水洗至中性，再加4倍量的2mol/LNaOH溶液，攪拌4小時(shí)，除去堿液，用水洗至中性備用。處理時(shí)一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。

如果是親水型離子交換劑，只能用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl溶液處理(室溫下處理30分鐘)。第44頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

離子交換劑的再生是指對使用過的離子交換劑進(jìn)行處理，使其恢復(fù)原來性狀的過程。酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。

離子交換劑的轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過程。如對陰離子交換劑用HCl處理可將其轉(zhuǎn)為Cl型，用NaOH處理可轉(zhuǎn)為OH型，用甲酸鈉處理可轉(zhuǎn)為甲酸型等等。對離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型的目的是一致的，都是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。

第45頁,共66頁，2024年2月25日，星期天長期使用后的樹脂含雜質(zhì)很多，欲將其除掉，應(yīng)先用沸水處理，然后用酸、堿處理之。長期使用的樹脂，需先用沸水處理，然后用酸處理，若含有脂溶性雜質(zhì)，可用乙醇或丙酮處理。長期使用過的親水型離子交換劑的處理，一般只用酸、堿浸泡即可。對瓊脂糖離子交換劑的處理，在使用前用蒸餾水漂洗，緩沖溶液平衡后即可。離子交換劑去除雜質(zhì)的原則：不破壞離子交換劑的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，不影響其原有的交換容量。第46頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、分離物質(zhì)的交換

有兩種方法：柱層析法（動態(tài)法）

分批法

（靜態(tài)法）

離子交換劑的裝柱量，要依據(jù)其全部交換量和待吸附物質(zhì)的總量來計(jì)算，當(dāng)溶液中含有各種雜質(zhì)時(shí)，必須考慮使其交換量留有余地。例子見書P93第47頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

(1)離子交換層析柱選擇

簡單的層析柱可用堿式滴定管代替，底部熔接有濾板。柱的高度依分離物質(zhì)的不同而定，當(dāng)所用的交換劑與待分離物質(zhì)各組分之間的親和力相差不多而需要交換劑的體積較大時(shí)，可增加柱的長度，使待分離的組分被洗脫后再結(jié)合于交換劑上的概率增加，使性質(zhì)相近的組分能較好地分離，因而增加了分辨率。柱的直徑與高度的比以1：20左右為宜。

如采用離子強(qiáng)度較大的梯度洗脫時(shí)，以選用粗而短的柱子為宜柱高與直徑的比例要降低，甚至為2：1。因?yàn)楫?dāng)柱上洗脫液的離子強(qiáng)度高到足以完全取代被吸附的離子時(shí)，這些被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動，如果柱細(xì)長，即從脫附到流出之間的距離長，使脫附的離子擴(kuò)散的機(jī)會增加，結(jié)果造成分離峰過寬，降低分辨率。用交聯(lián)葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時(shí)，常用的柱高為15～20cm。三、樣品上柱、洗脫和收集第48頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

(2)裝柱

轉(zhuǎn)型再生好的交換劑先放入燒杯，加少量水，邊攪拌邊倒人垂直固定的層析柱中，使交換劑緩慢沉降。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻，不應(yīng)有明顯的分界線，嚴(yán)防氣泡產(chǎn)生，否則將嚴(yán)重影響交換性能。為防止氣泡和分界線(即所謂“節(jié)”)的出現(xiàn)，在裝柱時(shí)，可在柱內(nèi)先加入一定高度的水，一般為柱長的1／3，再加入交換劑就可借水的浮力而緩慢沉降。同時(shí)控制排液口放速率，以保持交換劑面上水的高度不變，交換劑就會連續(xù)地緩慢沉降，“節(jié)”和氣泡就不會產(chǎn)生。

離子交換劑的裝柱量要依據(jù)其全部交換量和待吸附物質(zhì)的總量來計(jì)算。當(dāng)溶液含有各種雜質(zhì)時(shí)，必須考慮使交換量留有充分余地，實(shí)際交換量只能按理論交換量的25％～50％計(jì)算。在樣品純度很低時(shí)，或有效成分與雜質(zhì)的性質(zhì)相近時(shí)，實(shí)際交換量應(yīng)控制得更低些。第49頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

裝柱完畢，通過恒流泵加入起始緩沖溶液，流洗交換劑，直至流出液的pH與起始緩沖溶液相同。關(guān)閉層析柱出液口，準(zhǔn)備加樣。打開柱出液口，待緩沖溶液下移至柱床表面時(shí)，關(guān)閉出液口。用滴管加入已用起始緩沖溶液平衡后的樣品。沿柱內(nèi)壁滴加樣品，待樣品液加到一定高度后，再移向中央滴加，務(wù)必使樣品液均勻分布于柱床全表面。然后打開出液口，待樣品液全部流人柱床時(shí)，先用少量起始緩沖溶液沖洗柱內(nèi)壁，再接上洗脫裝置，按一定速率加入洗脫液，開始層析分離。第50頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

經(jīng)過離子交換被吸附在離子交換劑上的待分離物質(zhì)，有二種洗脫辦法：一是增加離子強(qiáng)度，使洗脫液中的離子能爭奪交換劑的吸附部位，從而將分離的物質(zhì)置換下來；二是改變pH，使樣品離子的解離度降低，電荷減少，因而對交換劑的親和力減弱而被洗脫下來。

從洗脫液的成份而言，洗脫方式有三種：一是選用單一洗脫液。此為恒液洗脫法，適用于組分不大復(fù)雜的樣品；二是選用幾種洗脫能力逐步增強(qiáng)的洗脫液相繼洗脫，此為階段洗脫法，適用于各組分對交換劑親和力比較懸殊的樣品；三是用離子強(qiáng)度和pH呈連續(xù)梯度變動的洗脫液進(jìn)行洗脫，使洗脫能力持續(xù)增強(qiáng)，此為梯度洗脫法，適用于各組分與交換劑親和力相近的樣品。

第51頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，溶液的梯度是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。第52頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

由于被吸附的物質(zhì)不一定是所要求的單一物質(zhì)，因此除了正確選擇洗脫液外，還采用控制流速和分部收集的方法來獲得所需的單一物質(zhì)。因不同物質(zhì)的極性不同，容易交換的先流出來，根據(jù)先后順序就能得到較純的物質(zhì)。第54頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

洗脫液的流速不僅與所用交換劑的結(jié)構(gòu)、顆粒大小及數(shù)量有關(guān)，而且與層析柱的粗細(xì)及洗脫液的粘度有關(guān)，很難定出一定的標(biāo)準(zhǔn)，必須根據(jù)具體條件，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，才能得出適合于特定層析條件的洗脫液流速，一般控制在5～8mL／(cm2?h)。經(jīng)洗脫流出的溶液可用部分收集器分部收集，收集的體積一般以柱體積的1％～2％為宜。若降低分部收集體積，可提高分辨率。分部收集洗脫液經(jīng)相關(guān)的檢測分析，便可得知所含物質(zhì)的數(shù)量。也可以用監(jiān)測儀顯示收集的洗脫液在特定波長的吸光度(A)代表被分離物質(zhì)的濃度，以此為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的洗脫體積為橫坐標(biāo)，繪制出洗脫曲線。第55頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

在某些實(shí)驗(yàn)條件下，離子交換層析的洗脫，也選用階梯式或復(fù)合式梯度洗脫液。實(shí)踐中采用何種形式的梯度洗脫，完全決定于分離要求，無規(guī)律可循。一般從線性梯度開始，然后逐步摸索試驗(yàn)，以獲得適用于實(shí)驗(yàn)的合適洗脫方式。第56頁,共66頁，2024年2月25日，星期天部分收集器梯度混合器層析柱柱層析設(shè)備可見光分光光度計(jì)蠕動泵第57頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

企業(yè)利用的層析柱第58頁,共66