基于RAW264.7細(xì)胞的雞骨草辛素抗炎作用研究

基于RAW264.7細(xì)胞的雞骨草辛素抗炎作用研究【摘要】目的：基于RAW264.7細(xì)胞，研究雞骨草辛素(BJBS)在體外的抗炎作用。方法：采用CCK8法測定BJBS對RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力影響，利用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7細(xì)胞，從而建立體外炎癥模型，考察不同濃度BJBS對LPS誘導(dǎo)RAW264.7產(chǎn)生NO和ROS的含量水平的影響，以及ELISA法測定RAW264.7細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)的水平。結(jié)果：BJBS顯著抑制了因LPS刺激而活化的巨噬細(xì)胞的活力，同時顯著降低RAW264.7巨噬細(xì)胞NO和ROS的產(chǎn)生，減少細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-β及IL-18的釋放，均呈現(xiàn)濃度依賴性。結(jié)論：BJBS具有抗炎活性，BJBS可通過抑制NO和ROS的產(chǎn)生，從而抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激作用來抑制炎癥反應(yīng)，有望成為新一代高效低毒的抗炎藥物。【關(guān)鍵詞】雞骨草辛素；RAW264.7細(xì)胞；抗炎

StudyonTheAnti-inflammatoryEffectofAbrusamideHBasedonRAW264.7Cells[Abstract]Objective:Toinvestigatetheanti-inflammatoryeffectofBJBS.Methods:Inthisstudy,lipopolysaccharide(LPS)-inducedmouseRAW264.7macrophageinvitroinflammationmodelwasusedtodeterminethecellviabilityofRAW264.7byCCK8method,thelevelsofNOandROSproducedbyLPSinducedbyLPSinducedbydifferentconcentrationsofBJBSwereinvestigated,andthepro-inflammatorycytokinesinterleukin-6(IL-6),tumornecrosisfactor-α(TNF-α),andinterleukin-1β(IL-1β)secretedbyRAW264.7cellsweremeasuredbyELISAandlevelsofinterleukin-18(IL-18).Results:BJBSsignificantlyinhibitedtheviabilityofLPS-stimulatedmacrophages,significantlyreducedtheproductionofNOandROSinRAW264.7macrophages,andreducedthereleaseofIL-6,TNF-α,IL-βandIL-18incells,allofwhichwereconcentration-dependent.Conclusion:BJBShasanti-inflammatoryactivity,andBJBScaninhibitinflammatoryresponsebyinhibitingandreducingtheproductionofNOandROS,inhibitingintracellularoxidativestress,andisexpectedtobecomeanewgenerationofhigh-efficiencyandlow-toxicityanti-inflammatorydrugs.[Keywords]AbrusamideHRAW264.7cellsAnti-inflammatory

目錄TOC\o"1-4"\u1前言 前言毛雞骨草的概述毛雞骨草，為嶺南特色中藥材之一，主產(chǎn)于廣西，為豆科相思子屬植物毛相思子的干燥全草；雞骨草，主要分布在廣東、廣西、海南和福建等地，為豆科植物廣州相思子的帶根全草，是毛雞骨草的同屬基源藥材，二者的化學(xué)成分和藥理活性相似[1]，都具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)菌、抗病毒和抗腫瘤等功效[2]。毛雞骨草由于易栽培種植，且具有相當(dāng)多的藥理活性，有著非常巨大的研發(fā)成新藥的潛力。有研究表明毛雞骨草中含有以吐昔酸和吐星酸為母核結(jié)構(gòu)的氨基酸酰胺類成分[1,3]，吐昔酸和吐昔酸衍生物具有多種藥理活性，此類衍生物以其獨特的結(jié)構(gòu)和生物活性吸引了國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。雞骨草辛素(AbrusamideH，BJBS)是從毛雞骨草中提取得到的吐昔酸衍生物，見圖1，目前尚未有報道對BJBS藥理活性進行研究，其活性作用機制也不明確。圖1雞骨草辛素的化學(xué)結(jié)構(gòu)吐昔酸及其衍生物的概述吐昔酸是一種可以從多種植物中分離出來的天然產(chǎn)物。研究表明，吐昔酸具有一定的抗炎作用。在動物實驗中，吐昔酸及其衍生物4，4’-二羥基-α-吐昔酸均表現(xiàn)出良好的抗炎活性，后者抗炎活性與洛索洛芬鈉相當(dāng)，但弱于雙氯芬酸鈉[4,5]。因此，吐昔酸母核作為一個近年來逐漸被發(fā)掘的優(yōu)勢結(jié)構(gòu)，其衍生物具有作為抗炎藥物先導(dǎo)化合物進行下一步優(yōu)化篩選的潛力。我們從毛雞骨草中提取的天然產(chǎn)物雞骨草辛素中同樣具有該優(yōu)勢結(jié)構(gòu)，基于以上研究結(jié)果表明，吐昔酸及其衍生物具有潛在的抗炎作用，可能成為治療炎癥相關(guān)疾病的新型藥物候選物，故對雞骨草辛素進行抗炎作用研究。炎癥的概述炎癥，是機體應(yīng)對刺激的一種防御機制[6]，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙。在機體遇到生物性因子、變態(tài)反應(yīng)、壞死組織、化學(xué)性因子等的致炎因子的刺激時，將會產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在炎癥反應(yīng)過程中，以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞，將會通過產(chǎn)生細(xì)胞因子等物質(zhì)，限制并消除損傷因子，同時也促進受損組織的愈合。液體的滲出可以稀釋毒素，免疫細(xì)胞吞噬搬運壞死組織以利于再生和修復(fù)[6]。因此，炎癥是機體天然存在的機制，目的是為了保護機體。一般而論，炎癥是對機體有利的。但在某些情況下，炎癥又是具有潛在危害的，有研究表明多種慢性疾病與炎癥反應(yīng)明顯相關(guān)，如冠心病[7]、阿爾茲海默癥[8,9]、糖尿病腎病[10]和癌癥[11]等疾病。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的先天免疫細(xì)胞，起到防御外源性刺激的作用，廣泛分布于體內(nèi)。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜結(jié)構(gòu)成分，LPS能夠使中性粒細(xì)胞[12]和巨噬細(xì)胞[13]活化，LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥是一種常用的體外炎癥模型[14-17]，廣泛用于抗炎藥物的篩選。當(dāng)LPS被免疫細(xì)胞膜上的特異性受體識別并結(jié)合時，炎癥通路便會被LPS信號級聯(lián)激活，使得巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)如一氧化氮(NitricOxide，NO)和活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)直接或間接參與炎癥反應(yīng)。炎癥過程中NO通過參與宿主的防御反應(yīng)，調(diào)節(jié)其他炎癥分子的合成等過程，當(dāng)機體產(chǎn)生過量的NO，會進一步誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并且可導(dǎo)致組織損傷[18]。氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，ROS含量是否保持動態(tài)平衡影響體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS過多積累會引起體內(nèi)氧化過激，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生凋亡，這些反應(yīng)均會導(dǎo)致組織損傷和功能喪失。因此，減少NO和ROS等炎癥介質(zhì)的釋放是治療炎癥的關(guān)鍵。抗炎藥的概述抗炎藥是一種用于治療炎癥性疾病的藥物，能改善紅、腫、熱、痛、機能障礙等癥狀。其中，治療以炎癥為基礎(chǔ)的疾病時，常常使用非甾體抗炎藥(NonsteroidalAntiinflammatoryDrugs，NSAIDs)。NSAIDs通過抑制環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase，COX)來減輕炎癥和疼痛，雖然抗炎藥物對許多炎癥性疾病具有顯著的治療效果，但其使用也會存在許多副作用，如胃腸道不適、心血管系統(tǒng)問題[19]。因此，通過對已有的抗炎藥的相關(guān)基團進行修飾，并從中找到高效低毒的抗炎藥，也可以通過尋找抗炎中藥中起到抗炎作用的有效成分，發(fā)展新型抗炎藥。在國內(nèi)，中草藥成為了一個熱門的抗炎癥領(lǐng)域。許多研究表明，中草藥具有良好的抗炎作用，可用于治療許多炎癥性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等。此外，近年來，基于抗體和細(xì)胞免疫學(xué)的新型抗炎藥物也受到了越來越多的關(guān)注。生物制劑包括抗腫瘤壞死因子(TumorNecrosisFactor，TNF)抑制劑和白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)抑制劑等，被廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，一些新型的抗炎藥物如Janus激酶抑制劑(JAK抑制劑[20])也受到了越來越多的關(guān)注。RAW264.7細(xì)胞的概述RAW264.7巨噬細(xì)胞是從小鼠腫瘤中分離出來的細(xì)胞株，不是天然存在的巨噬細(xì)胞，與人類巨噬細(xì)胞在某些方面存在差異，并且該細(xì)胞無法模擬復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，可能會受到細(xì)胞培養(yǎng)條件、處理劑量和時間等因素的影響導(dǎo)致結(jié)果存在一定的偏差，結(jié)果僅供參考。但由于該細(xì)胞易于獲取和培養(yǎng)，生長快速，數(shù)量可控；對多種刺激物質(zhì)反應(yīng)性強，可以評估不同化合物或者藥物的抗炎活性；也可以通過基因編輯技術(shù)對其進行改造，增加特定受體或者信號通路的表達(dá)，便于研究相關(guān)的分子機制的這些原因，該細(xì)胞仍然被廣泛應(yīng)用于體外炎癥模型。本實驗對BJBS干預(yù)下的RAW264.7細(xì)胞進行細(xì)胞活性測定，建立以LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞體外炎癥模型，檢測NO、ROS和細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量，考察BJBS的體外抗炎作用，為闡明BJBS抗炎作用及機制和開發(fā)BJBS成新型抗炎藥物提供理論支撐。

試劑和儀器藥品和試劑藥品和試劑見表1。表1藥品和試劑名稱來源雞骨草辛素(BJBS)，純度>99%廣東藥科大學(xué)中藥開發(fā)研究所袁旭江老師課題組提供RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中國科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫二甲基亞砜(DimethylSulfoxide，DMSO)廣州瑞舒生物科技有限公司醋酸地塞米松大連美侖生物科技有限公司胎牛血清(FetalBovineSerum，F(xiàn)BS)美國Gibco公司高糖DMEM培養(yǎng)基美國Gibco公司DCFH-DA活性氧檢測試劑盒上海碧云天生物科技有限公司ELISA試劑盒江蘇酶免生物科技有限公司青鏈霉素混合液(100*)北京索萊寶科技有限公司CCK8廣州瑞舒生物科技有限公司一氧化氮試劑盒南京建成生物工程研究所脂多糖美國sigma公司去離子水和泰純水器自制儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備見表2。表2儀器和設(shè)備名稱來源SynergyHTX酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司H1850臺式離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司BSA224S-CW萬分之一分析天平賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司HF90二氧化碳培養(yǎng)箱上海力申科學(xué)儀器有限公司DMi8manual倒置熒光顯微鏡德國Lecia公司

實驗方法溶液的制備0.5%DMSO溶液的制備稱取0.5gDMSO，加入去離子水，使去離子水與DMSO的重量為100g，攪拌溶解，備用。BJBS和醋酸地塞米松溶液的制備精密稱取BJBS和醋酸地塞米松，用“3.1.1”項下制備的0.5%DMSO溶液溶解BJBS和醋酸地塞米松，得到BJBS溶液及醋酸地塞米松溶液。實驗時用DMEM作為溶劑稀釋至所需濃度，并保持DMSO的濃度為0.5%。如無特別說明，醋酸地塞米松溶液濃度均為50.00μg/ml。RAW264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)將RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，將RAW264.7巨噬細(xì)胞在添加10%熱滅活FBS，100U/mL青霉素和鏈霉素溶液的DMEM中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶中并放置在37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中。待RAW264.7細(xì)胞密度約在80%時，即可進行傳代，一般一天傳代一次。測定BJBS對RAW264.7巨噬細(xì)胞毒性用CCK-8法測定細(xì)胞活力。將RAW264.7巨噬細(xì)胞以1.0×105個/孔的密度接種于96孔板中，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，在每個孔內(nèi)加入100μL不同濃度的BJBS溶液(80.00、160.00、320.00、640.00、960.00和1280.00μg/mL)，并建立調(diào)零組(DMEM溶液)和空白對照組(細(xì)胞懸液+DMEM溶液)，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，在每個孔內(nèi)加入CCK8溶液10μL，孵育2h。孵育完成后，取出96孔板，放其放置于酶標(biāo)儀中檢測450nm處吸光度值，并通過式1計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=測定BJBS對RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響用CCK-8法測定細(xì)胞活力。將RAW264.7巨噬細(xì)胞以1.0×105個/孔的密度接種于96孔板中，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，在每個孔內(nèi)加入100μL不同濃度的BJBS溶液(250.00、500.00、750.00、1000.00和1250.00μg/mL)，同時在調(diào)零組(DMEM溶液)和空白對照組(細(xì)胞懸液+DMEM溶液)中各加入100μLDMEM溶液，預(yù)處理4h后，用LPS(1.00μg/mL)刺激細(xì)胞，孵育24h。孵育完成后，取出96孔板，每孔加入CCK8溶液10μL，孵育2h。孵育完成后，取出96孔板，放其放置于酶標(biāo)儀中檢測450nm處吸光度值，并通過式1計算細(xì)胞存活率。測定RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO含量將RAW264.7巨噬細(xì)胞以1.0×106個/孔的密度接種于12孔板中，孵育24h。用250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液預(yù)處理細(xì)胞1h后，用LPS(1.00μg/mL)刺激細(xì)胞。孵育6h后，用Griess試劑法檢測培養(yǎng)上清液中亞硝酸鹽濃度。精確吸取50μL各組細(xì)胞上清液至96孔板中，隨后每孔分別加入50μLGriessA液和B液，置于振蕩儀中100rpm振蕩10min。振蕩完成后，將其放置于酶標(biāo)儀中檢測540nm處吸光度值，檢測結(jié)束后計算各組細(xì)胞上清液中NO的含量。測定RAW264.7巨噬細(xì)胞中ROS含量將RAW264.7巨噬細(xì)胞以1.0×106個/孔的密度接種于12孔板中，孵育24h。用250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液預(yù)處理細(xì)胞1h后，用LPS(1.00μg/mL)刺激細(xì)胞，孵育24h后，用PBS緩沖液洗滌兩次，并加入10μMDCFH-DA檢測試劑。保持溫度于37℃并且對巨噬細(xì)胞進行避光處理，孵育30min后，用PBS緩沖液洗滌兩次，再使用倒置熒光顯微鏡對巨噬細(xì)胞觀察并拍照。測定RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β含量將RAW264.7巨噬細(xì)胞以1.0×106個/孔的密度接種于12孔板中，孵育24h。用250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液預(yù)處理細(xì)胞1h后，加入LPS(1.00μg/mL)刺激細(xì)胞6h。然后收集培養(yǎng)基，以1000rpm離心15min，收集上清液。采用ELISA試驗盒檢測IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β上清液中細(xì)胞因子的含量。統(tǒng)計學(xué)處理實驗所得計量數(shù)據(jù)均以X±S表示。采用GraphPadPrism8軟件對所得數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01具有顯著性差異，P<0.001具有極其顯著性差異。

結(jié)果細(xì)胞毒性測定從圖2可以看出，與空白組進行對比，各濃度的BJBS實驗組中RAW264.7巨噬細(xì)胞的存活率都高于80%，與空白組相比沒有顯著性差異。因此，可以認(rèn)為選擇250.00、500.00和1000.00μg/mL的BJBS溶液對RAW264.7巨噬細(xì)胞無顯著毒性。圖2BJBS對RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性測定結(jié)果細(xì)胞活力測定從圖3可以看出，與空白組進行對比，經(jīng)過LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力顯著升高，證明成功建立體外炎癥模型。與LPS組相比，LPS+BJBS組明顯抑制了RAW264.7巨噬細(xì)胞活力增長，而不同濃度的BJBS對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖抑制能力呈現(xiàn)濃度依賴性抑制作用。圖3BJBS對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力測定結(jié)果。與對照組比較，###P＜0.001；與LPS組比較，***P＜0.001,**P＜0.01，*P＜0.05。RAW264.7細(xì)胞中NO含量結(jié)果從圖4可以看出，與空白組進行對比，經(jīng)過LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO含量顯著升高，說明成功建立體外炎癥模型。與LPS組相比較，LPS+醋酸地塞米松陽性對照組能顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，不同濃度的BJBS+LPS實驗組也能明顯抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO，并且不同濃度的BJBS+LPS組對抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力呈濃度依賴性抑制作用。雖然BJBS和醋酸地塞米松均有抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力，但醋酸地塞米松在比BJBS濃度更低的情況下，對RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制能力更強。圖4LPS誘導(dǎo)的各組RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO的含量測定結(jié)果。與對照組比較，###P＜0.001；與LPS組比較,***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。RAW264.7巨噬細(xì)胞中ROS含量結(jié)果從圖5可以看出，與空白組進行對比，經(jīng)過LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROS顯著增加，說明成功建立體外炎癥模型。與LPS組相比，LPS+醋酸地塞米松陽性對照組顯著抑制了RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS，不同濃度的BJBS+LPS實驗組也能明顯抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS，并且不同濃度的BJBS+LPS實驗組對RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的抑制能力呈濃度依賴性抑制作用。雖然BJBS和醋酸地塞米松均有抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力，但醋酸地塞米松在比BJBS濃度更低的情況下，對RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的抑制能力更強。圖5各組RAW264.7巨噬細(xì)胞中ROS的含量測定結(jié)果。與對照組比較，###P＜0.001；與LPS組比較,***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。RAW264.7巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β含量結(jié)果從圖6可以看出，與空白組進行對比，經(jīng)過LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量顯著升高，說明成功建立體外炎癥模型。LPS+醋酸地塞米松陽性對照組的上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量明顯低于LPS組，具有顯著性差異。不同濃度的BJBS+LPS實驗組的上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量低于LPS組，但IL-6和IL-18的含量在低濃度水平時，與LPS組沒有顯著性差異。雖然BJBS和醋酸地塞米松均有抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β的能力，但醋酸地塞米松在比BJBS濃度更低的情況下，對RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α、IL-18和IL-1β的抑制能力更強。圖6各組RAW264.7巨噬細(xì)胞上清液中IL-6的含量測定結(jié)果。A:IL-6；B:TNF-α；C:IL-1β；D:IL-18。與對照組比較，###P＜0.001；與LPS組比較，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。

討論炎癥，是由于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞在抵御感染、創(chuàng)傷和自身壞死組織的影響時而出現(xiàn)的一種防御機制。炎癥反應(yīng)中，先天免疫細(xì)胞會釋放細(xì)胞因子、NO和ROS等致炎因子使得炎癥部位血管擴張，又因為炎癥介質(zhì)的作用，導(dǎo)致血管通透性增加，導(dǎo)致液體滲出，出現(xiàn)水腫。而由于血管擴張，也會將先天免疫細(xì)胞帶到發(fā)生炎癥反應(yīng)的部位，先天免疫細(xì)胞重復(fù)上述過程，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過度，對機體造成損害。故控制NO、ROS、細(xì)胞因子的釋放和抑制先天免疫細(xì)胞的遷移和聚集對控制炎癥有著重大意義。在測定ROS含量時，使用PBS對細(xì)胞及孔板進行洗滌是非常重要的，通過清洗掉未能進入到細(xì)胞中的DCFH-DA能夠有效避免拍照過程中出現(xiàn)的背景熒光，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。在測定細(xì)胞因子含量時，利用洗滌液將結(jié)合不理想的一抗和二抗清洗掉，能夠保證在測定吸光度時，減少偶然誤差，提高檢測的重現(xiàn)性，而終止液加入時間對結(jié)果影響也非常大。加入時間過早或者過晚，都會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線不理想，影響實驗結(jié)果。本實驗結(jié)果表明，BJBS能有效抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO、ROS和細(xì)胞因子，對控制炎癥起到了積極作用。進行BJBS對RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性測試時，能發(fā)現(xiàn)BJBS的毒性較低，在進行BJBS對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力測定、NO產(chǎn)生量、ROS產(chǎn)生量和細(xì)胞因子產(chǎn)生量的抑制試驗時，發(fā)現(xiàn)BJBS表現(xiàn)出了抗炎活性，即BJBS有作為新型高效低毒的抗炎藥的潛力。

總結(jié)與展望本實驗基于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞對BJBS進行體外抗炎作用研究。在炎癥區(qū)域中，以巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞會分泌細(xì)胞因子和趨化因子，并由此激活蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各種氧化應(yīng)激產(chǎn)物。氧化應(yīng)激產(chǎn)物的產(chǎn)生也會促進炎癥細(xì)胞分泌更多的致炎因子，進一步增大炎癥反應(yīng)。實驗結(jié)果表明BJBS在不顯著抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的生長活性條件下，能夠抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞因LPS誘導(dǎo)而產(chǎn)生的細(xì)胞增殖。通過檢測RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO、ROS、IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量，發(fā)現(xiàn)BJBS能以濃度依賴性抑制NO和ROS的生成，也能抑制IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18的生成。據(jù)此結(jié)果，我們推測BJBS是通過抑制NO和ROS的產(chǎn)生來抑制氧化應(yīng)激作用，減少核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NuclearFactorKappa-B，NF-κB)通路的激活，從而減少促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本實驗基于RAW264.7細(xì)胞對BJBS的體外抗炎作用進行了研究，闡述了BJBS產(chǎn)生抗炎作用的機制，但由于RAW264.7細(xì)胞是體外炎癥模型，無法模擬復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，故在往后的研究中可以對BJBS進行體內(nèi)抗炎作用的研究，即通過建立體內(nèi)炎癥模型[21,22]，觀察動物體內(nèi)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移和聚集情況，還可以通過監(jiān)測動物的NO等致炎因子的含量，從而得到BJBS在體內(nèi)抗炎作用的具體數(shù)據(jù)，為將BJBS開發(fā)成一種新型高效低毒的抗炎藥提供基礎(chǔ)。綜上所述，BJBS能夠抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞由于LPS誘導(dǎo)而產(chǎn)生的細(xì)胞增殖和釋放致炎因子的作用，具有體外抗炎作用，因此BJBS有望成為一種新型高效低毒的抗炎藥。

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