飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定

2飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定本文件規(guī)定了飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、飼料原料（動物源性、植物源性飼料原料）及精料補(bǔ)充料中細(xì)菌總數(shù)的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1細(xì)菌總數(shù)bacterialcount飼料試樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）試樣中形成的細(xì)菌總數(shù)。注：主要作為判定飼料被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在飼4原理試樣經(jīng)過處理，稀釋至適當(dāng)濃度，在一定條件下培養(yǎng)后（如用特定的培養(yǎng)基，在溫度36℃±1℃下培養(yǎng)48h±2h等），所得每g（mL）試樣中所含細(xì)菌總數(shù)。5培養(yǎng)基或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純的試劑。5.1水：GB/T6682三級。5.2平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.1。5.3磷酸鹽緩沖液（稀釋液）：見附錄A中A.2。5.40.85%生理鹽水：見附錄A中A.3。5.5實驗室常見消毒藥品。5.61mol/L氫氧化鈉溶液。5.71mol/L鹽酸溶液。6儀器設(shè)備6.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。6.2均質(zhì)器。6.3微型混合器。6.4恒溫水浴鍋：46℃±2℃。6.5高壓滅菌器。6.6分析天平：精準(zhǔn)到0.01g。6.7pH計或精密pH試紙。6.8菌落計數(shù)器或放大鏡。6.9振蕩器。6.10滅菌三角瓶（或無菌均制袋）。6.11滅菌移液管或微量移液器及吸頭。6.12滅菌試管。6.13滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。7樣品7.1采樣原則樣品的采集應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。采樣過程應(yīng)遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污7.2采樣方法7.2.1應(yīng)在同一批次產(chǎn)品中采集樣品，每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗的要求，一般不少于500g（mL）。7.2.2獨立包裝小于等于500g（mL）的樣品，取完整包裝。7.2.3獨立包裝大于500mL的液態(tài)產(chǎn)品，應(yīng)在采樣前搖動或用無菌棒攪拌液體，使其達(dá)到均質(zhì)后采集適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內(nèi)作為一件樣品。7.2.4獨立包裝大于500g的固態(tài)產(chǎn)品，應(yīng)用無菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內(nèi)作為一件樣品。7.3采集樣品的貯存和運輸7.3.1應(yīng)盡快將樣品送往實驗室檢驗。7.3.2應(yīng)在運輸過程中保持樣品完整。7.3.3應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存樣品，或采取必要措施防止樣品中微生物數(shù)量的變化。8試驗方法8.1試樣的稀釋8.1.1以無菌操作稱取25g樣品，放于含有225mL稀釋液或生理鹽水的滅菌三角瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃株）或無菌均質(zhì)袋中。置振蕩器上充分振蕩30min，或用拍擊式均質(zhì)器怕打1min～2min，制成1﹕10的樣品均液。8.1.2用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1﹕10樣品均液1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL無菌稀釋液或0.85%生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管，或放微型混合器上，混合30s，混合均勻，制成1﹕100的樣品均液。48.1.3另取一只1mL無菌吸管，按上述操作方法，作10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即更換一支無菌吸管或吸頭。8.1.4根據(jù)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇游廴緺顩r的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品均液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品均液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液或0.85%生理鹽水加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。8.1.5稀釋液移入平皿后，及時將約15mL～20mL涼至45℃~50℃的培養(yǎng)基（可放置于46℃±2℃恒溫水浴鍋內(nèi)保溫）傾注平皿，小心轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使試樣與培養(yǎng)基充分混均。8.2培養(yǎng)8.2.1待瓊脂凝固后，倒置平皿于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。8.2.2如估計試樣可能在培養(yǎng)基平皿表面彌漫生長時，待培養(yǎng)基完全凝固后，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)，凝固后倒置平皿，按8.2.1條件進(jìn)行培養(yǎng)。8.2.3試驗程序圖試驗程序圖見附錄B。8.3細(xì)菌計數(shù)8.3.1細(xì)菌計數(shù)時，可用肉眼觀察，如菌落形態(tài)小時可借助于放大鏡或菌落計數(shù)器檢查，以防遺漏。細(xì)菌計數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunit,CFU）表示。8.3.2選擇菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間,無蔓延菌落生長的平板計數(shù)細(xì)菌總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄成多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均值。8.3.3兩個平板其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2代表一個平皿細(xì)菌數(shù)。8.3.4當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。9結(jié)果報告9.1細(xì)菌總數(shù)的計算9.1.1若只有一個稀釋度平板上的細(xì)菌數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板細(xì)菌數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中細(xì)菌總數(shù)結(jié)果。上述數(shù)據(jù)按9.2.2數(shù)字修約后,表示為16000或1.6×104。9.1.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板細(xì)菌數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按下列公式計算：N=∑Cn1+0.1n2d式中:N——樣品中細(xì)菌數(shù)；5——平板(含適宜范圍細(xì)菌數(shù)的平板)細(xì)菌數(shù)之和；n1——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個數(shù)；n2——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。N==4=27545上述數(shù)據(jù)按9.2.2數(shù)字修約后,表示為28000或2.8×104。9.1.3若所有稀釋度的平板上細(xì)菌數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均細(xì)菌數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。上述數(shù)據(jù)按9.2.2數(shù)字修約后,表示為310000或3.1×105。9.1.4若所有稀釋度的平板細(xì)菌數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均細(xì)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。上述數(shù)據(jù)按9.2.2數(shù)字修約后,表示為270或2.7×102。9.1.5若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無細(xì)菌生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。9.1.6若所有稀釋度的平板細(xì)菌數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均細(xì)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。上述數(shù)據(jù)按9.2.2數(shù)字修約后,表示為3100或3.1×103。9.2細(xì)菌總數(shù)的報告9.2.1細(xì)菌總數(shù)小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。9.2.2細(xì)菌數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約，取前兩位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按照“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。9.2.3若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。69.2.4稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。7（規(guī)范性）培養(yǎng)基或材料A.1平板計數(shù)瓊脂(platecountagar,PCA)培養(yǎng)基A.1.1成分胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖瓊脂三級水A.1.2制法5.0g2.5g1000mL將上述成分加入三級水中，煮沸溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min。A.2磷酸鹽緩沖液（稀釋液）A.2.1成分磷酸二氫鉀34.0g三級水1000mLA.2.2制法儲存液：稱取34.0g磷酸二氫鉀溶解于500mL三級水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH7.2后，在用三級水稀釋至1000mL后儲存于冰箱。稀釋液：取儲存液1.25mL，用三級水稀釋至1000mL，分裝適宜容器或每管9mL，121℃高壓滅菌15min。A.30.85%生理鹽水稱取氯化鈉（分析純）8.5g，溶于1000mL三級水中。分裝三角瓶中，121℃高壓滅菌15min。8（規(guī)范性）細(xì)菌總數(shù)試驗程序圖細(xì)菌總數(shù)試驗程序見圖B.1。檢樣25g（mL）＋225mL稀釋液均質(zhì)10倍系列稀釋選擇適宜3個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿中，同時作空白對照每平皿中加入15mL～20mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)