蛋白質(zhì)的定性定量分析

關(guān)于蛋白質(zhì)的定性定量分析

蛋白質(zhì)定性分析

(qualitativeanalysis)

確定樣品中是否有蛋白質(zhì)存在，以及存在的是何種蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)定量分析

(quantitativeanalysis)

確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白成分的含量第2頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法（重點(diǎn)掌握）

蛋白質(zhì)相對(duì)分子量測(cè)定(SDS)

等電聚焦電泳(IEF)（一般了解）

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析

(westernblot)第3頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一章蛋白質(zhì)的含量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量測(cè)定基于蛋白質(zhì)的元素組成特點(diǎn)基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)基于蛋白質(zhì)的光吸收特性第4頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％

由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此只要測(cè)定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%第5頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、紫外光譜(A280)吸收法

這一方法可用來(lái)快速檢測(cè)溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分。通常用于柱層析過(guò)程中檢測(cè)蛋白質(zhì)的洗脫峰第6頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近

大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡(jiǎn)便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第7頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)

快速缺點(diǎn)

核酸可引起強(qiáng)干擾作用芳香族氨基酸含量差異可以起誤差

對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)破壞性

不是嚴(yán)格的定量，適用于測(cè)定蛋白質(zhì)粗提液第8頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項(xiàng)

石英比色杯

調(diào)零所用溶液

配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液

光密度范圍第9頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、考馬斯亮藍(lán)G-250檢測(cè)法

這是一種迅速、可靠的通過(guò)染色法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量的方法第10頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理

該法是基于考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。藍(lán)色復(fù)合物在595mn波長(zhǎng)處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測(cè)595mn的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量第11頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天所需時(shí)間10min優(yōu)點(diǎn)

快速（反應(yīng)時(shí)間僅需2min）

敏感，幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)損失缺點(diǎn)

用這種測(cè)定方法對(duì)蛋白質(zhì)引起不可逆的變性

對(duì)各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不同第12頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法注意事項(xiàng)

反應(yīng)10～15min后開(kāi)始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀

若選用目的蛋白來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或用另一種方法來(lái)校正，所測(cè)蛋白濃度較準(zhǔn)確第13頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、Lowry檢測(cè)法

這一標(biāo)準(zhǔn)、快速的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)方法已得到廣泛應(yīng)用.第14頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量第15頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)

一種可靠的蛋白質(zhì)定量方法

不同蛋白質(zhì)之間差別很小缺點(diǎn)

某些試劑不穩(wěn)定

干擾物質(zhì)多

使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性第16頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法注意事項(xiàng)

在加入試劑30min后呈色達(dá)到飽和，時(shí)間延長(zhǎng)顏色信號(hào)減弱

許多干擾物質(zhì)降低顏色反應(yīng)

高鹽濃度可引起沉淀第17頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、BCA(二喹啉甲酸)檢測(cè)法

這是近年來(lái)新研制的一種改進(jìn)的Lowry測(cè)定法第18頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理

在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2＋還原成Cu＋。而B(niǎo)CA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量第19頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)

檢測(cè)敏感性高缺點(diǎn)

蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性

終產(chǎn)物穩(wěn)定巰基試劑和去垢劑干擾第20頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量測(cè)定分子量測(cè)定(molecularweight,MW)排阻層析沉降平衡超速離心動(dòng)態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質(zhì)譜(ESI-MS)第21頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、SDS測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量1.不連續(xù)系統(tǒng)原理2.SDS凝膠的制備制備分離膠制備濃縮膠加樣裝板電泳卸板并進(jìn)行凝膠染色第22頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.SDS基本原理SDS

影響遷移率的因素

十二烷基硫酸鈉

(SodiumDodecylSulfate)

十二烷基磺酸鈉

(SodiumDodecylSulfonate)

第23頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天SDS作用：與蛋白牢固結(jié)合，當(dāng)其濃度大于1mmol/L時(shí)，SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)，由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電荷，使得樣品中各種蛋白質(zhì)與SDS形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子間天然的電荷差異第24頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同(雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒狀的復(fù)合物)，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SDS中，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對(duì)數(shù)線(xiàn)性關(guān)系WatchSDS原理第25頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.SDS測(cè)定分子量的操作

標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及處理

待測(cè)樣品的制備

電泳分離及染色

相對(duì)遷移率的計(jì)算WatchSDS操作第26頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天AnalysisforSDSelectrophoresis第27頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.注意事項(xiàng)

選擇合適的膠濃度

樣品中高濃度的陽(yáng)離子可能會(huì)導(dǎo)致SDS的沉淀，應(yīng)在加入樣品緩沖液之前將其除去SDS與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合程度

蛋白質(zhì)的分子量范圍15～200KD之間

二硫鍵是否完全被還原

溶液中SDS的濃度

溶液的離子強(qiáng)度第28頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天

多亞基蛋白質(zhì)分子量檢測(cè)

用其它方法測(cè)定分子量進(jìn)行參照SDS和巰基乙醇SDS測(cè)定的準(zhǔn)確性

電荷異?；驑?gòu)象異常

帶有較大輔基的蛋白質(zhì)

某些結(jié)構(gòu)蛋白第29頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、凝膠過(guò)濾層析測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量1.基本原理2.凝膠過(guò)濾測(cè)定分子量的操作

分子篩效應(yīng)

洗脫體積與相應(yīng)分子量的關(guān)系裝柱平衡加樣平衡洗脫收集樣品并計(jì)算Ve繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)第30頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第31頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.注意事項(xiàng)

柱床表面不能干燥

凝膠的選擇Sephadex溶脹G值的意義

凝膠柱的再生與保存第32頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)第33頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)兩性電解質(zhì)性質(zhì)支持介質(zhì)(supportingmedia)FigureofIEF第34頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10IsoelectricFocusing第35頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天ReadyStripTMIPGStrips3–104–73–65–87–103–10NL3.9–5.14.7–5.95.5-6.76.3-8.3High-puritymonomersNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteinsOverlappinggradientsfor“cybergels”Threelengths7cm,11cmand17cm0.5mmx3.3mm第36頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天BroadRangepH3-10NarrowRangepH4-7MicroRangepH4.7-5.931044774.75.94.75.9第37頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)

兩性電解質(zhì)的選擇

電極緩沖液

對(duì)樣品的要求

樣品必須無(wú)鹽

加樣的量要適當(dāng)

加樣方法

加樣位置第38頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)

蛋白質(zhì)的免疫印跡分析第39頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天

印跡技術(shù)(blotting)是指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）于或直接放在固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)

1975年，EdwenSouthern提出了分子印跡(漬)的概念目前這種技術(shù)已被廣泛用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的檢測(cè)第40頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天印跡技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用

DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析

RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析

蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究由于蛋白質(zhì)常用抗體來(lái)檢測(cè)，因此也被稱(chēng)為免疫印跡技術(shù)(immunoblotting)第41頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、免疫印跡分析的應(yīng)用對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分析生物大分子相互作用分析第42頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天將蛋白質(zhì)固定在膜上的其他應(yīng)用

結(jié)構(gòu)域分析斑點(diǎn)印跡抗體純化為制備抗體時(shí)獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原蛋白質(zhì)鑒定：氨基酸組成分析和序列分析第43頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、免疫印跡分析的基本流程

電泳分離蛋白

轉(zhuǎn)移至固相膜

封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)

與第一抗體溫育反應(yīng)

與第二抗體交聯(lián)物溫育反應(yīng)

顯色制備蛋白樣品蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移抗體檢測(cè)第44頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫印跡操作流程圖第45頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.樣品的制備

組織或細(xì)胞中提取

裂解

去污劑(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-20)

蛋白酶抑制劑(PMSF、EDTA、Pepstatin、

Leupeptin、Aprotinin)

蛋白質(zhì)的定量(Bradford、BCA、Lowry)

基因工程表達(dá)重組產(chǎn)物第46頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.電泳分離

SDS

非變性PAGEEIF第47頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移方法：半干法、濕法

作用：將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上

注意：在疊放硝酸纖維素膜、聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，膜與膠之間要緊密貼在一起，中間不能有任何氣泡?。康?8頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移膜種類(lèi)微孔大小結(jié)合能力特點(diǎn)NC膜0.45um80-100ug/cm2應(yīng)用廣泛<20kD易丟失PVDF膜0.22um0.45um80-100ug/cm2170-200ug/cm2<20kD不易丟失容量大、強(qiáng)度高尼龍膜480ug/cm2用于核酸第49頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天電轉(zhuǎn)移裝置第50頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天電轉(zhuǎn)移示意圖第51頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天電轉(zhuǎn)移裝置第52頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)

封閉

—對(duì)轉(zhuǎn)移膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉，防止抗體非特異性結(jié)合在膜上，降低背景顏色BSA、脫脂奶粉第53頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天第54頁(yè),共59頁(yè)，2024年2月25日，星期天

靶