紅細胞檢驗的基本方法

關(guān)于紅細胞檢驗的基本方法

一、SI(serumiron)的測定1.原理SFPH↓+還原劑→Fe2++顯色劑→絡(luò)合物成年男性11.6～31.3μmol／L成年女性9.0～30.4μmol／L降低：見于缺鐵性貧血（IDA）、慢性失血和感染等。增高：見于肝疾病、鐵粒幼細胞貧血、慢性溶血和反復(fù)輸血等。第2頁,共42頁，2024年2月25日，星期天二、SF(serumferritin)的測定（125I標(biāo)記SF+待測血SF）+定量抗體→125I復(fù)合物1+復(fù)合物2125I標(biāo)記SF+定量抗體→125I復(fù)合物32、參考值：成人男性15～200μg／L，女性12～150μg／L,小兒低于成人；3、臨床評價：①降低：見于IDA早期、失血、慢性貧血等。②增高：見于肝疾病、血色病、急性感染和惡性腫瘤等。第3頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

三、TIBC測定1.過量鐵標(biāo)準(zhǔn)液+血清→SF2.SFPH↓+還原劑→Fe2++顯色劑→有色絡(luò)合物TIBC：男性50～77μmol／L

女性54～77μmol／LUIBC：25.1～51.9μmol／L①增高：見于IDA和紅細胞增多癥等。②降低或正常：見于肝疾病、惡性腫瘤、溶血性貧血、慢性感染和腎病綜合征等。第4頁,共42頁，2024年2月25日，星期天四、鐵吸收率測定當(dāng)體內(nèi)缺鐵時，鐵蛋白的利用加快，腸道對鐵吸收也增加?？诜派湫?9Fe，測定體內(nèi)59Fe放射性量比率的變化，可推算出鐵吸收率。正常值:26.0％～35.0％增加：見于IDA，可高達50％～80％。降低：見于腸道吸收不良綜合征。正常：見于正常人、再障、巨幼細胞貧血、急性失血等。第5頁,共42頁，2024年2月25日，星期天五、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白測定免疫散射比濁法：利用抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白血清與待檢測的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，其光吸收和散射濁度增加，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，可計算出轉(zhuǎn)鐵蛋白含量。免疫散射比濁法為28.6～51.9μmol／L。增高：見于IDA和妊娠。降低：常見于腎病綜合征、肝硬化、惡性腫瘤、炎癥等。第6頁,共42頁，2024年2月25日，星期天六、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體測定雙抗體夾心法。1.血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體+抗體2.抗原抗體復(fù)合物+酶抗體；3.加入底物和顯色劑，其顏色的深淺與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的量成正比。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出未知標(biāo)本的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平。升高：常見于缺鐵性貧血和溶血性貧血。降低：見于再障、慢性病貧血、腎功能衰竭等。用于臨床觀察骨髓增生狀況和治療反應(yīng)。第7頁,共42頁，2024年2月25日，星期天小低貧的初步診斷1.HGB（g/L）男性<120女性<1102.HCT<0.35男性<0.40女性3.RBC（1012/L）男性<4.0女性<3.54.MCV(fl)<80fl=10-15L5.MCH(pg)<27pg=10–12g6.MCHC<0.32第8頁,共42頁，2024年2月25日，星期天血清鐵指標(biāo)檢驗的應(yīng)用

小細胞低色素性貧血的鑒別鐵總鐵結(jié)合力鐵飽和度鐵蛋白缺鐵貧減低增高減低減低?地貧正常正常正常正/高慢感貧減低正/低減低增高鐵粒貧增高減低增高增高第9頁,共42頁，2024年2月25日，星期天一、血清和紅細胞葉酸測定葉酸測定（measurementoffolacin）RIA，核素+葉酸→放射碘葉酸化合物。血清葉酸：成年男性8.61～23.8nmol／L葉酸減低：巨幼細胞貧血，紅細胞過度增生（如溶貧、骨髓增生性疾病等）。

女性7.93～20.4nmol／L紅細胞與血清中的葉酸濃度相差幾十倍，當(dāng)未發(fā)生巨幼細胞貧血時，紅細胞葉酸測定對判斷葉酸缺乏尤其有價值。紅細胞葉酸：成人340～1020nmol／L紅細胞第二節(jié)葉酸和維生素B12的檢驗第10頁,共42頁，2024年2月25日，星期天二、血清維生素B12測定RIA法，用抗氧化劑和氰化鉀在堿性環(huán)境下（pH＞12）,將人血清中的維生素B12從載體蛋白中釋放出來。加入57Co標(biāo)記的維生素B12,與固定在微晶纖維顆粒上純化的維生素B12結(jié)合物競爭結(jié)合，檢測其放射活性，其量與受檢血清的維生素B12含量成反比，與標(biāo)準(zhǔn)管作對照，換算出維生素B12含量。成人148～660pmol／L降低：巨幼細胞貧血。增高：白血病患者\真性紅細胞增多癥\惡性腫瘤和肝細胞損傷第11頁,共42頁，2024年2月25日，星期天四、血清內(nèi)因子阻斷抗體測定用57Co標(biāo)記的維生素B12與血清中的內(nèi)因子結(jié)合，形成57Co標(biāo)記的維生素B12－內(nèi)因子復(fù)合物；當(dāng)存在內(nèi)因子抗體時,形成的復(fù)合物的量減少。檢測其放射活性，與陽性對照管進行比較，可得知內(nèi)因子抗體的存在。陰性：正常人，比值≤1.00±0.10陽性：比值≥陽性對照血清比值±0.10內(nèi)因子阻斷抗體陽性：多見于由維生素B12缺乏引起的巨幼細胞貧血、惡性貧血等。第12頁,共42頁，2024年2月25日，星期天紅細胞壽命測定（erythrocytelifespandetermination）是將放射性核素（51Cr）標(biāo)記的紅細胞注入血循環(huán)后，逐日觀察其消失率，記錄成活曲線，計算出紅細胞壽命。半壽期為25～32天紅細胞壽命縮短：（1）溶血性貧血，約為14天。（2）再生障礙性貧血，約為15～29天。第三節(jié)溶血的檢驗第13頁,共42頁，2024年2月25日，星期天四、血漿高鐵血紅素白蛋白檢測高鐵血紅素白蛋白+硫化銨銨血色原用光譜儀在綠光區(qū)558nm處有一最佳吸收區(qū)帶。正常人呈陰性血管內(nèi)溶血時，血漿中游離血紅蛋白大量增加，血漿中可檢測出高鐵血紅素白蛋白。第14頁,共42頁，2024年2月25日，星期天1、原理

五、血清結(jié)合珠蛋白(Hp)測定1.待側(cè)血清+Hb液→Hp-Hb復(fù)合物+未結(jié)合Hb。2.電泳分離出Hp-Hb復(fù)合物。電泳法0.5－1.6g/L1.減低：常見于各種溶血，尤其是血管內(nèi)溶血。排除嚴(yán)重肝病及傳單。2.增高：感染、SLE、創(chuàng)傷、惡腫、妊娠等。第15頁,共42頁，2024年2月25日，星期天六、尿卟啉檢測尿中卟啉類物質(zhì)在酸性條件下，經(jīng)乙醚提取，于405nm處顯紅色熒光，從而可對尿卟啉進行定性檢測。正常人呈陰性①增加：先天性紅細胞生成性卟啉病、遲發(fā)性皮膚型卟啉病、肝紅細胞生成型卟啉病等。②對缺鐵性貧血、鉛中毒、鐵粒幼細胞貧血和珠蛋白生成障礙性貧血等的診斷有一定價值。第16頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

五、尿含鐵血黃素試驗又稱Rous試驗。當(dāng)血紅蛋白通過腎濾過時，部分鐵離子以含鐵血黃素的形式沉積于上皮細胞，并隨尿液排出。尿中含鐵血黃素是不穩(wěn)定的鐵蛋白聚合體，其中的高鐵離子與亞鐵氰化鉀作用，在酸性環(huán)境下產(chǎn)生普魯士藍色的亞鐵氰化鐵沉淀。尿沉渣腎小管細胞內(nèi)外可見直徑1～3μm的藍色顆粒。正常人呈陰性①陽性提示慢性血管內(nèi)溶血，尿中有鐵排出。無論有無血紅蛋白尿，只要存在慢性血管內(nèi)溶血如PNH，本試驗結(jié)果即呈陽性，并可持續(xù)數(shù)周。②溶血初期，雖然有血紅蛋白尿，此時本試驗可呈陰性反應(yīng)。第17頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

一、紅細胞滲透脆性試驗滲透脆性試驗（osmoticfragilitytest）檢測紅細胞對不同濃度低滲鹽溶液的抵抗力。紅細胞在低滲鹽溶液中，當(dāng)水滲透其內(nèi)部達一定程度時，紅細胞發(fā)生膨脹破裂。開始溶血：75.2～82.1mmol／L（4.4～4.8g／L）NaCl完全溶血：47.9～54.7mmol／L（2.8～3.2g／L）NaCl①脆性增加：遺傳性球形紅細胞增多癥、橢圓形紅細胞增多癥和部分自身免疫性溶血性貧血。②脆性降低：珠蛋白生成障礙性貧血、血紅蛋白C、D、E病，低色素性貧血、肝疾病等。第四節(jié)紅細胞膜缺陷的檢驗第18頁,共42頁，2024年2月25日，星期天二、自身溶血試驗及其糾正試驗紅細胞在37℃孵育48小時，其間由于膜異常引起鈉內(nèi)流傾向明顯增加，ATP消耗過多；或糖酵解途徑酶缺乏所引起ATP生成不足等原因可導(dǎo)致溶血，稱為自身溶血試驗。在孵育時，加入葡萄糖或ATP作為糾正物，觀察溶血可否有一定的糾正，稱為糾正試驗。正常人紅細胞孵育48小時,不加糾正物的溶血率＜3.5％，加葡萄糖的溶血率＜1.0％，加ATP糾正物的溶血率＜0.8％。①遺傳性球形紅細胞增多癥自身溶血率增加，加入葡萄糖或ATP后明顯糾正。②G－6－PD缺乏癥等戊糖旁路代謝缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖糾正。③丙酮酸激酶缺乏癥時不能利用葡萄糖產(chǎn)生ATP,其自身溶血率明顯增加，加葡萄糖不能糾正，加ATP可糾正。④獲得性溶血性貧血或自身免疫性溶血時試驗結(jié)果常各有不同，對診斷意義不大。⑤本試驗不夠敏感和特異，僅對遺傳性球形紅細胞增多癥有較大診斷價值.第19頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

三、紅細胞膜三磷酸腺苷活性測定Na＋－K＋－ATP酶、Ca2＋－Mg2＋－ATP酶和Mg2＋－ATP酶都是紅細胞膜上的ATP酶。為測定酶的活性可分別測定酶作用于ATP的水解產(chǎn)物無機磷含量，若在基質(zhì)中只加入Ca2＋－Mg2＋－ATP酶可測定Ca2＋－Mg2＋－ATP酶的活性，若在基質(zhì)中加入Na＋、K＋、Mg2＋和ATP，測定的為Na＋－K＋－ATP酶和Mg2＋－ATP酶的共同含量，再在基質(zhì)中加入Na＋－K＋－ATP酶的抑制劑，測定結(jié)果僅為Mg2＋－ATP酶活性，兩者的差為Na＋－K＋－ATP酶活性。紅細胞膜Na＋－K＋－ATP酶：（2.93±0.67）mU／109紅細胞Ca2＋－Mg2＋－ATP酶：0.4～2.5μmol／L－1.mg膜蛋白.h－1遺傳性球形紅細胞增多癥：Na＋－K＋－ATP酶活性增加，Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性減低。蠶豆?。篊a2＋－Mg2＋－ATP酶活性降低。許多藥物作用于紅細胞時，Na＋－K＋－ATP酶和Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性改變。第20頁,共42頁，2024年2月25日，星期天四、酸化甘油溶血試驗當(dāng)甘油存在于低滲溶液氯化鈉磷酸緩沖液時，可阻止其中的水快速進入紅細胞內(nèi)，使溶血過程緩慢。但甘油與膜脂質(zhì)又有親和性，可使膜脂質(zhì)減少。當(dāng)紅細胞膜蛋白及膜脂質(zhì)有缺時，它們在pH6.85的甘油緩沖液中比正常紅細胞溶解速度快，導(dǎo)致紅細胞懸液的吸光度降至50％的時間（AGLT50）明顯縮短。正常人AGLT50＞290s遺傳性球形紅細胞增多癥AGLT50明顯縮短（25～150s）。自身免疫性溶血性貧血、腎功能衰竭、妊娠等AGLT50也可縮短。第21頁,共42頁，2024年2月25日，星期天五、高滲冷溶血試驗在高滲狀態(tài)下，溫度驟然變化影響紅細胞膜脂質(zhì)的流動性，并可能累及膜磷脂與膜骨架蛋白結(jié)合位點，紅細胞容易破裂而發(fā)生溶血。當(dāng)膜蛋白缺陷致膜表面積與體積比值降低，溶血率明顯增加。而膜表面積與體積比值增加，溶血率降低。高滲冷溶血試驗（hyperosmoticcoldhemolysistest）即測定紅細胞在不同濃度的高滲緩沖液中，從37℃水浴立即置于0℃水浴一定時間的最大溶血率。9mmol／L或12mmol／L蔗糖最大溶血率66.5％～74.1％7mmol／L蔗糖大溶血率0.1％～16.9％①遺傳性球形紅細胞增多癥明顯增加。②珠蛋白生成障礙性貧血和異常血紅蛋白病明顯降低。③自身免疫性溶血性貧血基本正常。2、參考值：第22頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

六、紅細胞膜蛋白電泳分析將制備的紅細胞膜樣品進行SDS－PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠)電泳，根據(jù)樣品中各蛋白相對分子質(zhì)量的不同，分離得到紅細胞膜蛋白的電泳圖譜，從而可見各膜蛋白組分百分率。各種膜蛋白組分百分率變化較大，多以正常紅細胞膜蛋白電泳圖譜作比較；或以帶3蛋白為基準(zhǔn)，各膜蛋白含量以與帶3蛋白的比例表示。許多溶血性疾病常見紅細胞膜蛋白異常。各種膜缺陷疾病如遺傳性球形紅細胞增多癥有收縮蛋白等含量減低或結(jié)構(gòu)異常。某些血紅蛋白病骨架蛋白等可明顯異常。第23頁,共42頁，2024年2月25日，星期天一、高鐵血紅蛋白還原試驗在血液中加入亞硝酸鹽使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，正常紅細胞的G－6－PD催化戊糖旁路使NADP變成NADPH，其脫的氫通過亞甲藍試劑的遞氫作用而使高鐵血紅蛋白（Fe3＋）還原成亞鐵血紅蛋白（Fe2＋），通過比色可觀察還原的多少。當(dāng)G－6－PD缺乏時，高鐵血紅蛋白還原率下降。正常人高鐵血紅蛋白還原率≥75％（臍帶血≥77％）G－6－PD缺乏時，高鐵血紅蛋白還原率下降。中間缺乏（雜合子）為31％～74％，嚴(yán)重缺乏（半合子或純合子）＜30％。第五節(jié)紅細胞酶缺陷的檢驗第24頁,共42頁，2024年2月25日，星期天二、變性珠蛋白小體生成試驗G－6－PD缺乏的病人血樣加入乙酰苯肼于37℃孵2～4小時，用煌焦油藍染色觀察紅細胞中珠蛋白小體的生成情況，計算含5個及以上珠蛋白小體的紅細胞的百分率。正常人含5個及以上珠蛋白小體的紅細胞，一般＜30％。G－6－PD缺乏癥常高于45％，故可作為G－6－PD缺乏的篩檢試驗。但還原型谷胱甘肽缺乏癥也增高；不穩(wěn)定血紅蛋白病含小體的細胞百分率為75％～84％，HbH病和化學(xué)物質(zhì)中毒時也增高。第25頁,共42頁，2024年2月25日，星期天三、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點試驗和活性測定在G-6-PD和NADP＋存在下，G-6-PD能使NADP＋還原成NADPH，后者在紫外線照射下會發(fā)出熒光。NADPH的吸收峰在波長340nm處，可通過單位時間生成的NADPH的量來測定G-6-PD活性。正常人有很強的熒光。G-6-PD缺陷者熒光很弱或無熒光；雜合子或某些G-6-PD變異者則可能有輕到中度熒光。正常人酶活性為（12.1±2.09）U/gHb。第26頁,共42頁，2024年2月25日，星期天四、丙酮酸激酶熒光斑點試驗和活性測定在二磷酸腺苷（ADP）存在的條件下丙酮酸激酶（pyruvatekinase，PK）催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化成丙酮酸，在輔酶Ⅰ還原型（NADH）存在的情況下丙酮酸被LDH轉(zhuǎn)化為乳酸，若標(biāo)記熒光于NADH上，此時有熒光的NADH變?yōu)闊o熒光的NAD。正常人丙酮酸激酶活性斑點在25分鐘內(nèi)消失。酶活性（15.0±1.99）U／gHb。熒光斑點不消失或時間延長說明丙酮酸激酶活性缺乏，中間缺乏（雜合子）時，熒光25～60分鐘消失，嚴(yán)重缺乏（純合子）時，熒光60分鐘不消失。第27頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

五、谷胱甘肽還原酶缺陷檢測谷胱甘肽還原酶（GR）催化反應(yīng)中NADPH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADP＋，熒光消失，通過在365nm處觀察熒光斑點消失的時間（GR熒光斑點試驗）反映谷胱甘肽還原酶的活性，或直接測定吸光度的變化（GR活性定量試驗）計算GR的活性。GR熒光斑點試驗：正常人熒光斑點15min內(nèi)消失GR活性定量：（7.17±1.09）U／gHb谷胱甘肽還原酶缺乏時，GR熒光斑點試驗15分鐘以后還有熒光存在，GR活性定量試驗活性低于7.17U／gHb。第28頁,共42頁，2024年2月25日，星期天一、紅細胞包涵體試驗紅細胞包涵體試驗（Heinz－bodyformingtest）是將煌焦油藍液與新鮮血液一起孵育，不穩(wěn)定血紅蛋白易變性沉淀形成包涵體。正常人＜（1％）①不穩(wěn)定血紅蛋白?。悍跤?～3小時多數(shù)紅細胞內(nèi)可出現(xiàn)變性珠蛋白肽鏈沉淀形成的包涵體。G－6－PD缺乏或紅細胞還原酶缺乏及化學(xué)物質(zhì)中毒等，紅細胞中也可出現(xiàn)包涵體。②HbH?。悍跤?小時就可出現(xiàn)包涵體，也叫HbH包涵體。第六節(jié)血紅蛋白異常的檢驗第29頁,共42頁，2024年2月25日，星期天1、原理：

二、血紅蛋白電泳檢測血紅蛋白電泳（hemoglobinelectrophoresis）是根據(jù)不同的血紅蛋白所帶電荷不同、相對分子質(zhì)量不同，其泳動方向和速度不同，經(jīng)一定電壓和時間的電泳，可分離出各自的區(qū)帶，同時對電泳出的各區(qū)帶進行電泳掃描，可進行各種血紅蛋白的定量分析。第30頁,共42頁，2024年2月25日，星期天2、參考值：（1）pH8.6TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳。正常血紅蛋白電泳區(qū)帶：HbA＞95％、HbF＜2％、HbA2為1.0％～3.1％。①通過與正常人的血紅蛋白電泳圖譜進行比較，可發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶。如HbH、HbE、HbBatrs、HbS、HbD和HbC等異常血紅蛋白異常。②HbA2增多，見于β珠蛋白生成障礙性貧血，為雜合子的重要實驗室診斷指標(biāo)。HbE病時也在HbA2區(qū)帶位置處增加，但含量很大（在10％以上）。HbA2輕度增加亦可見于肝病、腫瘤和某些血液病。。第31頁,共42頁，2024年2月25日，星期天三、抗堿血紅蛋白檢測將待檢的溶血液與一定量的NaOH溶液混合，作用1分鐘后加入半飽和硫酸銨中止堿變性反應(yīng)。胎兒血紅蛋白（HbF）抗堿變性作用強，沒有變性存在于上清液中，HbA變性沉淀，取上清液于540nm處測定吸光度，檢測出HbF的濃度。此試驗也稱為堿變性試驗，成人＜2％；新生兒＜40％①HbF絕對增多：珠蛋白生成障礙性貧血，重型者達30％～90％，中間型常為5％～30％，輕型小于5％。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征患者，可高達100％。②HbF相對增多可見于骨髓纖維化、白血病、漿細胞瘤等惡性疾病及再生障礙性貧血、PNH、卟啉病等。③HbF生理性增多見于孕婦和新生兒。第32頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

四、HbF酸洗脫法檢測HbF具有抗堿和抗酸作用，其抗酸能力比HbA強。將血涂片于酸性緩沖液中孵育，含HbF的紅細胞不被酸洗脫，可被伊紅染成紅色，而含HbA的紅細胞均被酸洗脫，不能被伊紅著色。正常血片中含HbF的著色紅細胞：成人＜0.01（1％）新生兒0.55～0.85（55％～85％）以后漸漸下降，2歲后幼兒＜0.02（2％）孕婦可有輕度增加。著色細胞增加：珠蛋白合成障礙性貧血重型患者大多數(shù)紅細胞染成紅色；輕型患者可見少數(shù)染成紅色的細胞；遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征紅細胞均為紅色。第33頁,共42頁，2024年2月25日，星期天五、異丙醇沉淀試驗不穩(wěn)定血紅蛋白較正常血紅蛋白更容易裂解，在異丙醇這種能降低血紅蛋白分子內(nèi)部氫鍵的非極性溶劑中，不穩(wěn)定血紅蛋白更快地沉淀。通過觀察血紅蛋白液在異丙醇中的沉淀現(xiàn)象對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢。正常人血紅蛋白液為陰性（30分鐘內(nèi)不沉淀）不穩(wěn)定血紅蛋白存在時，常于5分鐘時出現(xiàn)沉淀，20分鐘開始出現(xiàn)絨毛狀沉淀。血液中含有較多HbF、HbH、HbE時也可出現(xiàn)陽性結(jié)果。第34頁,共42頁，2024年2月25日，星期天六、熱變性試驗熱變性試驗（heatinstabilitytest）是根據(jù)不穩(wěn)定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性，觀察血紅蛋白液在50℃時是否出現(xiàn)沉淀，對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢。正常人熱沉淀的血紅蛋白＜1％血紅蛋白沉淀率增加，說明不穩(wěn)定血紅蛋白存在。第35頁,共42頁，2024年2月25日，星期天七、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測尿素或?qū)β裙郊姿崮芷茐难t蛋白的空間結(jié)構(gòu)，血紅蛋白的珠蛋白可被裂解成肽鏈亞單位，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳可分離出各肽鏈區(qū)帶。正常血紅蛋白HbA裂解后出現(xiàn)β、HbA、HbA2和α四條帶。本試驗若有異常血紅蛋白肽鏈的區(qū)帶出現(xiàn)，表示有異常血紅蛋白存在。對珠蛋白生成障礙性貧血的診斷和鑒別有參考價值。第36頁,共42頁，2