生物大分子物質(zhì)的制備

關(guān)于生物大分子物質(zhì)的制備生命大分子物質(zhì)通常是指：動物、植物和微生物在進(jìn)行新陳代謝時所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(包括酶)和核酸等有機(jī)化合物的總稱。

生命科學(xué)研究將進(jìn)入后基因組時代。分離純化和測試分析蛋白質(zhì)技術(shù)顯得十分重要。

本章將以蛋白質(zhì)和核酸為主線討論其制備的一般過程，即材料的選擇與處理、測定方法的確立、有效成分的抽提、粗品的純化和純品的鑒定(這部分移至后面的章節(jié)介紹)等步驟。

第2頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

材料的選擇與處理

一、材料的選擇

A.有效成分是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其他物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。

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B.有效成分在材料中存在的特點有效成分的含量一般較少如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬分之一。有效成分穩(wěn)定性較差大多數(shù)對酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感，易被微生物分解變質(zhì)。選用的材料不同，有效成分的含量就不同；選用的材料即使相同，但是部位或生長期不同，有效成分的含量也不盡相同。

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C.材料選擇應(yīng)遵循的原則有效成分含量多、穩(wěn)定性好來源豐富、保持新鮮提取工藝簡單有綜合利用價值等

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二、材料的處理

選擇到合適的材料后，應(yīng)及時使用，或采用冰凍或干燥等方法處理。同時還應(yīng)將易于去掉的非需物質(zhì)除去。

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1動物臟器

(1)冰凍

應(yīng)在很短時間內(nèi)置-10℃冰庫(可短期保存)或-70℃低溫冰箱(數(shù)月不變質(zhì))貯存。脫脂脂肪容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)，而且還會影響純化操作和制品得率。一般脫脂的方法有：

A.人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；

B.浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醚)中脫脂；

C.采用快速加熱(50℃左右)、快速冷卻的方法，使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去；

D.利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離。第7頁,共61頁，2024年2月25日，星期天(2)干燥

A.丙酮液中脫水，干燥后磨粉貯存?zhèn)溆茫?/p>

B.在沸水中蒸煮處理，烘干后能長期保存。第8頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

2植物組織

A.葉片用水洗凈即可使用；或在l0h內(nèi)置-4～-30℃冰箱貯藏備用。

B.植物種子需泡脹或粉碎才可使用。

材料含油脂較多時，要進(jìn)行脫脂處理。

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3微生物

為制備生命大分子物質(zhì)的主要材料之一。

用離心法收集到的上清液，可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分；可置低溫下短時間貯存。

收集到的菌體，經(jīng)破細(xì)胞處理后則可從中提取其他有效成分；或制成凍干粉，在4℃保存(數(shù)月不會變質(zhì))。第10頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

確立測定方法

一、目的與要求

測定哪些材料含有目標(biāo)有效成分？哪些材料含量豐富？提純過程純度是否逐漸增加？要確立專一、準(zhǔn)確、靈敏和簡便的測定方法。因為：有效成分在原材料中含量較低；底物要專一性的。第11頁,共61頁，2024年2月25日，星期天二、常用的測定方法

1.光譜法2.電化學(xué)法3.生物活性檢測法4.免疫分析法5.生物傳感器第12頁,共61頁，2024年2月25日，星期天1光譜法(1)吸收光譜法[①直接測定法；②比色法](2)熒光法(3)濁度法特點：測定時所需的樣品量較少，但往往能產(chǎn)生比較高的消光值；且操作簡單，反應(yīng)迅速、靈敏；結(jié)果也較準(zhǔn)確，

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(1)吸收光譜法

直接測定法、比色法

①直接測定法將待測物(如核酸、蛋白質(zhì))配制成一定濃度的溶液后，移至相應(yīng)波長的分光光度計中，即可從測定的消光值換算出待測物的含量。

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A.測定核酸含量

構(gòu)成核酸的堿基組分是分光光度計測定核酸含量的依據(jù)。

在測定過程中，DNA或RNA溶液濃度的增加或降低，會使其在波長260nm的消光值(A260)隨之增加或降低，二者之間成正比關(guān)系。第15頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

通常1個A260值分別相當(dāng)于雙鏈DNA50μg／ml單鏈DNA37μg／ml單鏈RNA40μg／ml

用A260／A280比值可確定DNA和RNA的純度：純DNA比值為1.8純RNA的比值為2.0當(dāng)此比值分別小于1.8和2.0時，表明樣品中已污染了蛋白質(zhì)或酚類等物質(zhì)。

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B.測定蛋白質(zhì)的含量及純度

蛋白質(zhì)(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由構(gòu)成蛋白質(zhì)組分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值決定的，胱氨酸的貢獻(xiàn)很小。第17頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

②比色法將待測物(如蛋白質(zhì)、核酸、糖類)與相關(guān)試劑(見表1-2)或酶的底物作用后，根據(jù)呈現(xiàn)的顏色或形成的產(chǎn)物特性，移至相應(yīng)波長的分光光計中，即可從測定的消光值換算出待測物的含量。

例如：

鄰苯二酚(在275nm有吸收峰)+鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶

黃色的α-羥基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰)

通過檢測375nm消光值的升高即可換算出所用酶的活力。

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還可用不同消光值之間的比值鑒定某些物質(zhì)的純度

例如

純細(xì)胞色素c還原型A550／氧化型A280比值為1.25~

1.28。假如比值過高或過低，就表明細(xì)胞色素C中污染了雜質(zhì)。

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(2)熒光法

特點：熒光法的精確性、重復(fù)性和靈敏度比吸收光譜法好。當(dāng)分析物含量低、用吸收光譜法不能檢測時，改用熒光法卻能求得滿意結(jié)果。

如：NAD(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸)（輔酶Ⅰ）NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（輔酶Ⅱ）由于NADH2和NADPH2發(fā)熒光，用于偶聯(lián)NADH2(或NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的還原反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行熒光測定。

第20頁,共61頁，2024年2月25日，星期天例子：

谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力測定采用與蘋果酸脫氫酶（MDH)相偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行。天冬氨酸+α-酮戊二酸GOT

草酰乙酸+谷氨酸

草酰乙酸+NADH+H+

MDH

L-蘋果酸+NAD+每生成1分子草酰乙酸就消耗1分子NADH，這樣GOT活力就可通過測定NADH在340nm消光值的下降來求得。

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(3)濁度法極稀的懸浮液可采用此法測定，即測定懸浮液在不被吸收的波長下表觀的消光值。

例如伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)的活力測定方法之一就是采用此法(A420)。培養(yǎng)液中細(xì)菌生長的濃度(A600)也可用此法測定。第22頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

2電化學(xué)法

有些反應(yīng)過程會放出質(zhì)子氫(H+)，可用靈敏的pH計或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化，從而計算出欲測物的含量或活力。

例如：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定該酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。

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3生物活性檢測法

大多數(shù)生命物質(zhì)，尤其是一些激素類物質(zhì)，當(dāng)把它們注射入動物的特定器官時，所屬機(jī)體將發(fā)生相應(yīng)的變化，并且二者間有一定的相關(guān)性。根據(jù)這一性質(zhì)設(shè)計的方法，即可對生命活性物質(zhì)進(jìn)行檢測。如：在某個動物器官中注射某種激素，使器官細(xì)胞加速分裂，通過檢測細(xì)胞的數(shù)量變化來推測激素的生物活性。第24頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

4免疫分析法

采用抗體與抗原之間發(fā)生的特異反應(yīng)，并結(jié)合放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記，就可對有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行靈敏的定性或(和)定量分析(詳見第十九章)。

5生物傳感器

用生物傳感器中的敏感膜（具有分子識別功能的生物活性材料如酶、蛋白、抗體、生物膜和微生物等作為敏感元件）與待測溶液中的某一物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，即可通過顯示器反映出有效成分的數(shù)量(詳見第十七章)。

第25頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

細(xì)胞的破碎

細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。有效成分可以分泌于細(xì)胞外，也有存在于細(xì)胞內(nèi)的。如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培養(yǎng)液中，用適當(dāng)?shù)娜軇┛芍苯犹崛　?/p>

存在于細(xì)胞內(nèi)的酶又有游離酶和結(jié)合酶之分，前者游離在細(xì)胞質(zhì)中，后者則與細(xì)胞器緊密結(jié)合(如氧化還原酶和有機(jī)磷水解酶等)。

第26頁,共61頁，2024年2月25日，星期天欲提取存在于細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)時，必須把細(xì)胞破碎（個別的則例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白）。動物臟器的細(xì)胞膜比較脆弱，極易破損，往往在組織絞碎或提取時就被破壞了。植物和微生物的細(xì)胞壁較牢固，需要在提取前進(jìn)行專門的破細(xì)胞操作。第27頁,共61頁，2024年2月25日，星期天一、機(jī)械破碎1研磨法剪碎的動物組織置研缽中，用研磨棒研碎。用勻漿器處理，也能把動物細(xì)胞破碎。大規(guī)模生產(chǎn)時，可用電動研磨法。細(xì)菌和組織的細(xì)胞破碎均可用此法。

2組織搗碎器法這是一種劇烈的破碎細(xì)胞方法。搗碎器(8000~10000r/min)處理30~45s，植物和動物細(xì)胞能完全破碎。

第28頁,共61頁，2024年2月25日，星期天3超聲波法

它是借助聲波的振動力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。

4壓榨法

此法是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。用1.77×108～3.54×108Pa的壓力迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個小孔(<細(xì)胞直徑的孔)，致使其被擠破、壓碎。5凍融法

將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時間，然后取出置室溫下(或40℃左右)迅速融化。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時，發(fā)生溶脹、破碎。

第29頁,共61頁，2024年2月25日，星期天二、溶脹和自溶

1溶脹

細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。

2自溶

細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶(如蛋白酶和酯酶等)作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱自溶。

第30頁,共61頁，2024年2月25日，星期天三、化學(xué)處理

脂溶性的溶劑可把細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解

四、生物酶降解

生物酶(如溶菌酶)有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時，先是細(xì)胞壁消解，隨之而來的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。

第31頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)抽提

一、抽提的含義

抽提通常是指用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒?，從原料中把有效成分分離出來的過程。經(jīng)過處理和破細(xì)胞原材料中的有效成分可用

緩沖液、稀酸、稀堿、或有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醇)等抽提；還可用蒸餾水抽提。

第32頁,共61頁，2024年2月25日，星期天一般理想的抽提溶液應(yīng)具備下述條件：對有效成分溶解度大，破壞作用?。粚﹄s質(zhì)不溶解或溶解度很??；來源廣泛、價格低廉、操作安全等。第33頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

二、抽提有效成分的影響因子

抽提時pH值、金屬離子、溶劑的濃度、極性等因子，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。

第34頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

1pH值

對蛋白質(zhì)或酶等具有等電點的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，一般選擇抽提液的pH值應(yīng)在偏離等電點的穩(wěn)定范圍內(nèi)。通常：抽提堿性蛋白質(zhì)選用低pH值的溶液；抽提酸性蛋白質(zhì)選用高pH值的溶液；或者用調(diào)至一定pH值的有機(jī)溶劑。第35頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

2溶劑的極性和離子強度

有些蛋白質(zhì)或酶在極性大、離子強度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強度低的溶液中穩(wěn)定。（1）通常降低極性的方法在水溶液中增加蔗糖或甘油的濃度。若用二甲基亞砜(DMSO)或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油時，會使溶液的極性大大降低。

（2）離子強度等于溶液中各離子濃度（C）與離子電荷數(shù)（Z）平方乘積總和的二分之一。在水溶液中加人中性鹽如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4能提高溶液的離子強度。一般來說：

離子強度較低的中性鹽溶液有促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，保護(hù)蛋白質(zhì)活性的作用；離子強度過高則會引起蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析作用。

第36頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

3水解酶

在抽提、純化蛋白質(zhì)或核酸時，其效果常常受到本身存在的水解酶的影響。這些酶在與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時，一旦條件適宜，就會發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實驗失敗。

防止方法（目的是使這些酶喪失活性）：①加入抑制劑(苯甲基磺酰氟化物，PMSF，見表1-1、1-2)，②調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子濃度或極性等方法，

第37頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

4溫度

一般認(rèn)為蛋白質(zhì)或酶制品在低溫(如0℃左右)時最穩(wěn)定。但有些物質(zhì)對溫度的要求卻與此不同。

例如：從鳥肝分離出的丙酮酸羧化酶對低溫敏感，25℃時才穩(wěn)定。有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶，置-10℃時會快速失活，移至21℃時兩天后開始失活，此后每天失活剩余酶的16％。若將其存放在6℃時失活速度較緩慢，每天約喪失活力0.75％。

第38頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

5攪拌

攪拌可促使欲抽提物與抽提液之間相互接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法，速度太快時容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類變性失活。

6氧化

存在氧化劑或氧分子時，會使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶(或蛋白質(zhì))失活(或變性)。在抽提液中加入還原劑時，就可以防止巰基發(fā)生氧化作用，或者延緩某些酶活性的喪失。在有些植物組織或微生物細(xì)胞中含有較多的酚類化合物，加入還原劑可防止褐化。第39頁,共61頁，2024年2月25日，星期天7金屬離子蛋白質(zhì)的巰基能和金屬離子如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。這些金屬離子主要來源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法:①用無離子水或重蒸水配制試劑；②在配制的試劑中加入1-3mmol／LEDTA(金屬離子絡(luò)合劑)。

8抽提液與抽提物的比例在抽提時，抽提液與抽提物的比例一般以5︰1為宜。如抽提液過多，則有利于有效成分的提取，但不利于純化工序的進(jìn)行。否則反之。

第40頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)

濃

縮

一般抽提液的體積都比較大，應(yīng)先進(jìn)行濃縮處理。常用的濃縮方法有下面幾種:沉淀法吸附法超過濾法透析法減壓蒸餾法冰凍干燥法第41頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

一、沉淀法

在抽提液中加入適量的中性鹽[如(NH4)2S04]或有機(jī)溶劑，使有效成分變?yōu)槌恋?見第二章)。經(jīng)離心分離，獲得有效成分。第42頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

二、吸附法

將干葡聚糖凝膠G25(或吸水棒)加入抽提液中，兩者比例為1︰5。由于凝膠吸水之故，抽提液的體積可縮小三倍左右，回收蛋白質(zhì)量約80％。第43頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

三、超過濾法

把抽提液裝入超過濾裝置(見圖1-1)，在空氣或氮氣(5.05×105Pa)壓力下，使小分子物質(zhì)(包括水分)通過半透膜(如硝酸纖維素膜)，大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)。第44頁,共61頁，2024年2月25日，星期天四、透析法

A.把裝抽提液的透析袋埋在吸水力強的聚乙二醇(polyetheyleneglycol，PEG，分子質(zhì)量>20kDa)或甘油中。10ml抽提液可在1h內(nèi)濃縮到幾乎無水的程度。這種方法的濃縮速度與透析袋的表面積以及PEG的數(shù)量有密切關(guān)系。B.真空透析

第45頁,共61頁，2024年2月25日，星期天五、減壓蒸餾法當(dāng)真空度較高時溶液的沸點可控制在30℃以下。這種方法一般適用于常溫下穩(wěn)定性好的物質(zhì)。第46頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

六、冰凍干燥法

冰凍的抽提液在真空狀態(tài)下，可以由固體直接變?yōu)闅怏w。用此原理進(jìn)行濃縮，有效成分幾乎不會破壞。凍干機(jī)

凍干機(jī)主要由：低溫干燥箱、真空泵和冷凍機(jī)構(gòu)成。

第47頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)

純化方案的設(shè)計與評價

純化方案：

是指在純化某一物質(zhì)過程中，將幾種分離方法(如沉淀法、離子交換層析、葡聚糖凝膠等)有機(jī)地互補聯(lián)合、靈活應(yīng)用的總稱。

第48頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

一、純化方案的設(shè)計

依據(jù)抽提液中有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異性，從諸多方法中挑選出兩種、兩種以上乃至更多種分離方法組成一個純化方案。各分離方法的排布：一般地，

先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積和后工序處理的方法；

后選用精確、費時和需樣品量少的方法。第49頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

二、純化方案的評價

對純化方案的評價，實質(zhì)上是對組成純化方案的每一種分離方法的評價。這種評價僅采用理論分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，只有經(jīng)過實踐檢驗才能正確得出。

第50頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

方法：純化過程的每一步收集到的溶液要進(jìn)行：有效成分的含量測定；并計算：比活力(活力單位數(shù)／毫克蛋白)純化倍數(shù)(每步的比活力／粗抽提液的比活力)收得率[(每步的總活力/粗抽提液總活力）×100％]

視純化倍數(shù)的大小，收得率的高低，就能初步確定每種分離方法的應(yīng)用價值。第51頁,共61頁，2024年2月25日，星期天一般認(rèn)為：凡是在特定實驗中能增大純化倍數(shù)和提高收得率的方法均屬有應(yīng)用價值的。反之，則應(yīng)用價值不大，也不宜采用。但是，在純化過程中，隨著純化倍數(shù)的增大，有效成分的含量卻是逐漸減少，收得率也往往<100％(除非抽提液中存在酶的抑制)。因此，實踐中對純化倍數(shù)和收得率的要求是根據(jù)材料來源的難易而變化的。若材料來源難，就希望提高收得率；反之，則希望提高純化倍數(shù)(見沉淀法)。

第52頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

例子

以從賽氏桿菌(Serratiasp．)提取L-門冬酰胺酶為例，說明純化方案與純化倍數(shù)和收得率的關(guān)系(見表1-7)。第53頁,共61頁，2024年2月25日，星期天表1-5L-門冬酰胺酶的純化比活力=活力單位數(shù)／毫克蛋白純化倍數(shù)=每步的比活力／粗抽提液的比活力收得率=每步的總活力/粗抽提液總活力×100％步驟總蛋白/g總活力/u比活力（u/mg）純化倍數(shù)收得率/%1.粗抽提液30210000.711002.氯化錳處理7.64150172.02.8723.冰凍融解5.58148722.73.8714.DEAE-纖維0.113502544.563.524素層析5.硫酸銨鹽析0.048336771.7102.0176.羥基磷灰石0.0163133200.0286.015柱層析7.PAGE0.0123100255.0365.015第54頁,共61頁，2024年2月25日，星期天此處，酶含量是用活力單位表示