醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)第21章 基因診斷

第21章基因診斷GeneDiagnosis

References《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)》（七年制統(tǒng)編教材）馮作化主編人民衛(wèi)生出版社

《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)》（第3版）藥立波主編人民衛(wèi)生出版社

2實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)發(fā)展簡史第四類20世紀(jì)80年代第三類20世紀(jì)60年代第二類20世紀(jì)50年代第一類基因診斷免疫學(xué)檢驗(yàn)代謝產(chǎn)物、酶活性變化細(xì)胞學(xué)檢查3基因變異致病

（1）內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常

（2）外源基因的入侵

點(diǎn)突變、缺失、插入易位、重排、擴(kuò)增基因變異疾病4先天遺傳性疾患——如鐮刀型貧血、白化病、紅綠色盲后天基因突變引起的疾病——如癌癥、心血管疾病基因變異致病5腫瘤的早期基因診斷6基因診斷一、基因診斷概述二、常用技術(shù)與方法三、應(yīng)用概念基本原理特點(diǎn)臨床意義7第一節(jié)

基因診斷概述指利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法，通過檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)功能的異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程?；蛩降牟∫蛟\斷基因診斷對(duì)象：DNA/RNA前提：已確定疾病表型與基因型的關(guān)系1.概念92.特點(diǎn)（2）特異性強(qiáng)、靈敏度高：由于基因診斷采用核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)；（3）適用范圍廣：健康預(yù)警、產(chǎn)前診斷、疾病易感性、藥物敏感性、病原體基因分型等。（1）直接檢測(cè)基因，屬病因診斷，針對(duì)性強(qiáng)；103.臨床意義

對(duì)有表型出現(xiàn)的疾病作出明確診斷

早期快速診斷

確定個(gè)體對(duì)疾病的易感性疾病的分期分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等11癥狀前篩查檢查對(duì)象：晚發(fā)型、高易感性、高風(fēng)險(xiǎn)性疾病或惡性腫瘤。

類型疾病名稱易感、或致病基因可選擇的預(yù)防、治療措施晚發(fā)型遺甲狀腺髓質(zhì)瘤RET預(yù)防性手術(shù)切除傳病成人型多囊腎多囊腎基因預(yù)防性手術(shù)切除、其他治療遺傳病易肝血色素病HFE預(yù)防性換血治療感基因攜靜脈血栓性梗凝血因子Ⅴ避免吸煙、口服避孕藥帶者塞基因(R506Q)

遺傳性癌遺傳性乳腺癌BRCA1、BRCA2監(jiān)測(cè)、預(yù)防性手術(shù)切除

癥易感基遺傳性非息肉MLH1、MSH2

因腸癌(HNPCC)12預(yù)測(cè)性遺傳篩查在個(gè)體的不同時(shí)期，針對(duì)不同對(duì)象進(jìn)行新生兒篩查以便早診斷、治療和預(yù)防育齡(婚前)對(duì)象篩查對(duì)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重疾病基團(tuán)攜帶者進(jìn)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)，防止遺傳病發(fā)生在后代。產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷提供終止患病胎兒繼續(xù)發(fā)育的選擇。預(yù)植入基因診斷(PGD)，又稱受精卵子宮著床前診斷，是針對(duì)體外授精、試管嬰兒等輔助生殖技術(shù)的基因診斷。13第二節(jié)

基因診斷的常用技術(shù)和方法(一)基因診斷的常用技術(shù)

樣品的核酸抽提目的序列的擴(kuò)增（PCR)分子雜交

（Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、點(diǎn)雜交、ASO、原位雜交和DNA芯片技術(shù)）信號(hào)檢測(cè)15TargetsandMolecularTechniquesDNASouthernblot,FISH,PCR,Sequencing,microarray,restrictionanalysis,RFLP，SSCPRNANorthernblot,RT-PCR,microarrays16BasicPrincipleDenatureHybridizeSouthern,FishPCRDNA:

denaturationandhybridizationofthehelixstructure17基本原理：核酸變性、復(fù)性復(fù)性RNADNA1.核酸分子雜交18核酸分子雜交的應(yīng)用

研究DNA分子中特異基因的定位及檢測(cè)確定兩種核酸分子間的序列相似性檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)19核酸分子雜交的流程示意圖待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未參與雜交的探針檢測(cè)雜交信號(hào)制備探針核酸片段探針標(biāo)記加入標(biāo)記核酸探針20探針（probe）探針：一段能與待測(cè)核酸片段互補(bǔ)結(jié)合、經(jīng)過特殊標(biāo)記的特異核苷酸序列。制備探針的方法：基因文庫法、逆轉(zhuǎn)錄法、人工合成法等通常為單鏈核苷酸片段探針一般帶有標(biāo)記物21探針的種類基因組DNA

探針cDNA探針（應(yīng)用最廣泛）寡核苷酸探針(Oligonucleotideprobes)RNA探針22探針序列的選擇致病微生物核酸中最保守、最特異的序列突變基因中含突變位點(diǎn)或突變區(qū)的序列待測(cè)基因編碼的mRNA序列23探針的標(biāo)記物放射性標(biāo)記物（放射自顯影）32P，35S，125I，3H非放射性標(biāo)記物（化學(xué)顯色）生物素，地高辛，熒光素，酶，金屬24常用的固相核酸雜交的方法

Southern印跡雜交法(Southernblotting)Nouthern印跡雜交法(Nouthernblotting)

斑點(diǎn)雜交(dotblothybridization)或狹縫雜交法(slotblothybridization)

菌落雜交法(clonyhybridization)原位雜交法(nucleicacidhybridizationinsitu)25SouthernblotNNTTNTT26FISHN2728／原位雜交可檢出被檢基因的空間位置狀況，即細(xì)胞的具體定位、數(shù)目及類型。29

2、聚合酶鏈反應(yīng)體外基因擴(kuò)增技術(shù)

（PolymeraseChainReaction，PCR）30基本原理變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C在體外不斷進(jìn)行DNA復(fù)制的過程31PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高操作簡單、省時(shí)對(duì)待檢原始材料質(zhì)量要求低高效率的基因擴(kuò)增技術(shù)32PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則引物的特異性（與非擴(kuò)增區(qū)的同源性＜70%）引物長度（15-30bp）G+C含量（45%-55%）引物自身/之間不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)3’3’5’5’5’5’33PCR的種類多重PCR(multiplexPCR）套式PCR（NestedPCR）PCR結(jié)合寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交法PCR-RFLP原位PCRRealtimePCR34PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析法凝膠電泳PCR/點(diǎn)雜交PCR/SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）

PCR/sequencingPCR/RFLP35三、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析疑膠電泳分析法通過凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，若特異擴(kuò)增出一條帶，該法即可判斷結(jié)果。注意平行對(duì)照：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物陽性對(duì)照陰性對(duì)照內(nèi)參照36限制性酶切分析法設(shè)計(jì)的引物，使擴(kuò)增片段包括某一種或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別序列，PCR反應(yīng)后用限制酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳檢測(cè)酶切片段長度的變化。37

采用能與擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部核苷酸序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針，實(shí)施斑點(diǎn)雜交或Southern印跡雜交當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶時(shí)，適用該法。核酸雜交法383.DNAsequencing最直接、最準(zhǔn)確39DNA芯片技術(shù)

DNAchipsormicroarray40基因芯片技術(shù)的流程BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayer

MicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis41基因芯片打印儀42自動(dòng)化4344單色熒光雜交結(jié)果Cye3Cye545雙色熒光疊加結(jié)果46DNA序列分析基因突變檢測(cè)及多態(tài)性分析基因表達(dá)譜分析基因診斷新藥研發(fā)及藥物篩選基因芯片基因芯片技術(shù)的應(yīng)用47基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)微型化和自動(dòng)化高度平行性巨大的信息產(chǎn)出率高度敏感性和專一性強(qiáng)大的類比性48（二）基因診斷的基本方法基因突變的檢測(cè)多態(tài)性分析基因表達(dá)異常的檢測(cè)外源基因的檢測(cè)49檢測(cè)已知的點(diǎn)突變：

PCR/ASO探針法

ASO：等位基因特異性寡核苷酸檢測(cè)未知的點(diǎn)突變：

PCR/SSCP/sequencingSSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析singlestrandconformationpolymorphism1.基因突變的檢測(cè)50等位基因的特異寡核苷酸（ASO)探針

當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針，用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)一般需要合成兩種探針，與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.

51PCR/ASO探針法52通過PCR同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)基因和野生型對(duì)照基因的DNA片段，將擴(kuò)增的雙鏈DNA變性成單鏈，用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。待測(cè)基因的單鏈DNA上單個(gè)堿基的改變可導(dǎo)致構(gòu)象的改變，其電泳遷移率也會(huì)發(fā)生改變。通過比較這兩者的遷移率，即可判斷是否發(fā)生基因突變。PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR/SSCP53正常人純合突變雜合突變PCR/SSCP分析+—54PCR結(jié)合序列分析不僅可以檢出有無突變，還能檢測(cè)突變的具體位置和突變類型、獲得堿基組成和順序改變的詳細(xì)信息。PCR/Sequencing552.多態(tài)性分析人群中不同個(gè)體間基因的核苷酸序列存在著差異性，稱為DNA的多態(tài)性，是生物多樣性的遺傳基礎(chǔ)。DNA多態(tài)性的發(fā)生可導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的增加、缺失或易位，使DNA分子的限制性酶切位點(diǎn)數(shù)目、位置發(fā)生改變。用限制酶切割基因組時(shí)，所產(chǎn)生的限制性片段的數(shù)目和每個(gè)片段的長度就不同，即所謂限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,

RFLP）56RFLP分析法（1）限制性酶切圖譜直接分析法（2）RFLP間接分析法

PCR/RFLP連鎖分析法57限制性內(nèi)切酶酶譜分析原理：某些疾病的發(fā)生是由于基因內(nèi)單一堿基的改變引起，當(dāng)此突變正好發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)切酶圖譜的改變，根據(jù)這一改變，綜合其它因素，可對(duì)疾病的發(fā)生診斷。MSTII識(shí)別位點(diǎn)：

CCTNAGG正常

-珠蛋白基因：5’－CCTGAGG－3’鐮刀型貧血：5’－CCTGTGG－3’實(shí)例分析：鐮刀型紅細(xì)胞性貧血58MMMMM正常－Hb鐮刀型貧血－Hb1.1kb0.2kb1.3kbAAASSS1.3kb1.1kb0.2kb5960DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）：小衛(wèi)星DNA；DNA指紋法短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR):1~4bp，微衛(wèi)星DNA數(shù)量多、分布均勻、易于檢測(cè)613.基因表達(dá)異常的診斷mRNA的定量分析：點(diǎn)雜交、逆轉(zhuǎn)錄PCR法、競爭性PCRmRNA定性分析：Northern印跡法DNA芯片技術(shù)：通過一次雜交即可平行檢測(cè)成千上萬個(gè)基因的表達(dá)狀況，從而在RNA診斷上具有顯著的優(yōu)越性。624.表觀遺傳學(xué)(epigenetic)DNA甲基化：DNA胞嘧啶(C)的第五位碳原子加上甲基(mC)

甲基化酶S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸CH3胞嘧啶5-甲基化胞嘧啶CpG二聯(lián)體基因組整體水平的甲基化檢測(cè)基因特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)新甲基化位點(diǎn)的尋找。63三、基因診斷的應(yīng)用

遺傳疾病的基因診斷（產(chǎn)前、產(chǎn)后診斷）感染性疾病的基因診斷（早期診斷）腫瘤的基因診斷（分類分型與預(yù)后監(jiān)測(cè)）基因診斷在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用（個(gè)體識(shí)別、親子鑒定）判斷個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型64(一)遺傳性疾病基因診斷直接基因診斷的前提是被檢測(cè)基因必須已被克隆，基因的正常順序和結(jié)構(gòu)已被闡明，致病突變也已經(jīng)清楚。直接診斷策略檢測(cè)已知的致病基因較長的DNA片段的突變：Southernblot已知點(diǎn)突變：RFLP,PCR/ASO未知點(diǎn)突變：PCR/SSCP先尋找點(diǎn)突變，再用序列分析652.間接診斷策略：

檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星DNA序列和單核苷酸多態(tài)性（SNP)。尋找具有基因缺陷的染色體，并判斷被檢者是否具有這條染色體。(一)遺傳性疾病基因診斷66(二)感染性疾病的基因診斷核酸分子雜交PCRDNA芯片技術(shù)外源基因的檢測(cè)67(三)腫瘤的基因診斷1.腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)（1）檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的突變癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因等（2）檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒的基因①與鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤有關(guān)的EB病毒②與宮頸癌有關(guān)的人類乳頭瘤病毒（HPV）③與肝癌有關(guān)的HBV、HCV

（3）檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物基因2.腫瘤相關(guān)基因表達(dá)譜分析68腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)p53基因突變的檢測(cè)①PCR-SSCP法：可檢測(cè)有無突變；②

PCR-sequencing：可檢出有無突變，突變的密碼子及突變、缺失或插入的堿基數(shù)及其部位；③PCR-RFLP法：可對(duì)突變后有酶切位點(diǎn)的消失或增加的突變進(jìn)行檢測(cè)。④p53寡核苷酸芯片69(四)基因診斷在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用通過人類遺傳基因分析來判斷父母與子女是否親生關(guān)系，稱之為親子鑒定。親子鑒定方法

目前國內(nèi)外進(jìn)行親子鑒定的試驗(yàn)手段主要有：①血型檢驗(yàn)（人類白細(xì)胞抗原分型）②DNA多態(tài)性檢驗(yàn)親子鑒定70DNA指紋法（DNAfingerprints）提取人基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶切成不同長度的片段（各種VNTRs上都沒有酶切位點(diǎn)），然后以VNTRs中的特異序列為探針進(jìn)行Southern雜交，可發(fā)現(xiàn)陽性片段的長度各不相同。由于不同個(gè)體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目和位置都不相同，所以VNTRs的Southern雜交帶譜就具有高度的個(gè)體特異性，稱其為DNA指紋，可用于親子鑒定、法醫(yī)鑒定等。71在親子鑒定中，小孩的DNA指紋均可在父親或母親指紋中找到相同位置的條紋，(用黑點(diǎn)虛線表示)，由此可看出，子代的DNA指紋均來自父親和母親的DNA指紋，而他人的指紋、與小孩的指紋無一相符。親子鑒定72DNA指紋分析法①一個(gè)DNA指紋探針可同時(shí)檢測(cè)十幾個(gè)，甚至幾十個(gè)位點(diǎn)的變異，因而DNA指紋更能反映基因組的特異性；②