器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座

器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生一．器官發(fā)生（一）概念：離體培養(yǎng)組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官過程。（二）發(fā)生方式：有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：（含有初生分生能力）外植體直接分化成器官過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）（2）間接發(fā)生：外植體（已分化成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官過程。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第1頁二）胚狀體方式(somaticembryo)指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具胚芽、胚根、胚軸胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長成完整植株。由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個不一樣發(fā)育階段：1)外植體細(xì)胞脫分化。外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子深入發(fā)育成胚。但在組織培養(yǎng)條件下胚狀體發(fā)育過程是：細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生連續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟有機(jī)體。我們把由愈傷組織類似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株在外觀上，這種方式和不定芽都有光滑、圓形突起形狀。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第2頁由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個不一樣發(fā)育階段：1)外植體細(xì)胞脫分化。外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成

在植物有性生殖中，精于和卵子結(jié)合形成合子，合子深入發(fā)育成胚。在組織培養(yǎng)條件下胚狀體發(fā)育過程類似于合子胚發(fā)育：細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生連續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟有機(jī)體。我們把由愈傷組織類似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株

在外觀上，這種方式和不定芽都有光滑、圓形突起形狀。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第3頁器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第4頁胚狀體與不定芽區(qū)分胚狀體在組織學(xué)上具備以下和不定芽不一樣三個特征：①最根本特征是含有兩極性，即在發(fā)育早期階段，從其方向相反兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。②胚狀體維管組織與外植體維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上聯(lián)絡(luò)，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織維管組織相聯(lián)絡(luò)。③胚狀體維管組織分布是獨(dú)立“v”字形，而不定芽維管組織無此現(xiàn)象。胚狀體也是植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生最常見而主要方式，它較不定芽方式有更多優(yōu)點(diǎn)：如胚狀體產(chǎn)生偽數(shù)量比不定芽多；胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和保留；胚狀體有性后代遺傳性更靠近母體植株。這些對組織培養(yǎng)應(yīng)用于育種是十分有利而主要。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第5頁胚狀體與合子胚比較合子胚胚狀體質(zhì)量萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率低，質(zhì)量差起源受精卵體細(xì)胞胚柄有，顯著即使有也不顯著形態(tài)固定，體積相對較小復(fù)雜，常有兩個以上子葉體積相對較大變異率低高器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第6頁（三）影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生原因

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第7頁1．生長調(diào)整物質(zhì)（1）生長素類：我們以離體培養(yǎng)條件下胡蘿卜體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)過程來進(jìn)行分析（教程P99），在離體條件下胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)育是一個包含兩個步驟過程，每個步驟需要一個不一樣培養(yǎng)基。愈傷組織建立和增殖所需要是一個含有生長素培養(yǎng)（增殖培養(yǎng)基），通常所用生長素是2，4-D，濃度范圍0.5—1mg/L。在這么一個培養(yǎng)上，愈傷組織若干部位分化形成份生細(xì)胞團(tuán)，稱作“胚性細(xì)胞團(tuán)”。在增殖培養(yǎng)基上重復(fù)繼代，胚性細(xì)胞團(tuán)數(shù)量不停增加，但并不出現(xiàn)成熟胚。然而，假如把胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到一個生長素含量很低或完全沒有生長素培養(yǎng)（成胚培養(yǎng)基）上，它們就能發(fā)育為成熟胚?？磥?，在增殖培養(yǎng)基中生長素存在，對于胚性細(xì)胞團(tuán)以后在成胚培養(yǎng)基上發(fā)育為胚是必不可少。邊疆保留在無生長素培養(yǎng)基中愈傷組織不能形成胚。在這個意義上，可把增殖培養(yǎng)基看成是體細(xì)胞胚胎發(fā)生：誘導(dǎo)培養(yǎng)基：，而把每個胚性細(xì)胞團(tuán)看成是一個無結(jié)構(gòu)胚。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第8頁（2）細(xì)胞分裂素類：細(xì)胞分裂素對于體細(xì)胞胚胎發(fā)生作用有相反結(jié)論，既或促進(jìn)也可抑制體細(xì)胞胚發(fā)生，這主要取決于植物種類及其基因型。普通而言，細(xì)胞分裂素對于促進(jìn)體細(xì)胞胚成熟有顯著作用，尤其有利于子葉發(fā)育。另外有研究表明，不一樣外植體對于細(xì)胞分裂素需要可能含有不一樣專一性，如在胡蘿卜研究中發(fā)覺，即使BAP和激動素對胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用，但濃度為0.1μmol/L玉米素卻能促進(jìn)這個過程，而BA對胡蘿卜則是促進(jìn)其愈傷組織增殖，但不形成胚性愈傷組織。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第9頁（3）赤霉素類：赤霉素類能抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，但對于許多植物而言，赤霉素對于體細(xì)胞胚胎成熟與萌發(fā)有促進(jìn)作用。（4）脫落酸：抑制劑尤其是ABA，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中作用正逐步被提醒出來，ABA是一個天然產(chǎn)生生長調(diào)整劑，當(dāng)把無抑制作用劑量（通常是0.1~1μM）ABA用于荷蘭芹屬培養(yǎng)物時，能夠允許胚成熟過程進(jìn)行。不過其抑制異常增殖，包含不定胚開啟。另首先抑制早熟萌發(fā)。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第10頁2．氮源氮源形態(tài)有還原態(tài)氮（NH4+）和氧化態(tài)氮（NO3—）兩種。在以KNO3為唯一氮源（如White培養(yǎng)基）培養(yǎng)上建立起來愈傷組織，去掉生長素以后不能形成胚。然而是，若在培養(yǎng)基中加入少許NH4Cl即可顯著促進(jìn)胚狀體發(fā)育，上述結(jié)論是否說明，胚胎發(fā)生過程中還原態(tài)氮是必需？我們能夠?qū)σ韵略囼?yàn)進(jìn)行分析。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第11頁Reinert及基合作者在栽培胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中(培養(yǎng)基均為White培養(yǎng)基)得到以下結(jié)果：[NH4+—氮]（M）[NO3——氮]（M）體胚發(fā)生數(shù)（個/2ml）10401131±21905519±0.309511.3±4.1

從上表能夠分析得出，盡管高濃度氧化態(tài)氮一樣能夠誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，不過其誘導(dǎo)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于還原態(tài)氮和氧化態(tài)氮配合使用時誘導(dǎo)率。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第12頁三．長久培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛力喪失有些愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物起初含有器官發(fā)生或胚胎發(fā)生潛力，但經(jīng)過重復(fù)繼代保留之后喧種形態(tài)發(fā)生能力經(jīng)常逐步下降，有些甚至完全損失。為了解釋這種現(xiàn)象，現(xiàn)在有三種假說。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第13頁1．遺傳說

該假說認(rèn)為，形態(tài)發(fā)生潛力喪失是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)細(xì)胞中核特征發(fā)生了改變，即細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)在培養(yǎng)繼代過程中因?yàn)樽儺惖仍蚨l(fā)生了改變或是突變。所以，能夠推知，由這種原因所造成形態(tài)發(fā)生潛力喪失是不可逆。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第14頁2．生理說

從前面體細(xì)胞胚胎發(fā)生中甜橙馴化組織形成實(shí)例中，不難分析，伴隨不停培養(yǎng)繼代進(jìn)行，培養(yǎng)組織或細(xì)胞中內(nèi)源激素平衡關(guān)系可能會發(fā)生改變，而造成不能形態(tài)發(fā)生。在這種情況下，細(xì)胞即使停頓了器官和胚胎分化，但并不一定就喪失了這種分化能力。因而，在這種情況下，假如改變外部處理?xiàng)l件，應(yīng)該有可能使細(xì)胞這種內(nèi)在潛力得到恢復(fù)。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第15頁3．競爭說

這個假說本質(zhì)上是前兩個假說結(jié)合。按照這個假說倡議者Smith和Street（1974）看法，在胡蘿卜細(xì)胞長其連續(xù)繼代培養(yǎng)基間，有兩個過程可能與胚胎發(fā)生能力下降以至最終喪失相關(guān)。首先，細(xì)胞對于生長素（2，4-D）抑制全能性表示作用變得比較敏感；基次，伴隨時間推移，因?yàn)榕囵B(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞學(xué)上不穩(wěn)定性，出現(xiàn)了缺乏胚性潛力新細(xì)胞系，這些細(xì)胞學(xué)上改變不一定是染色體數(shù)目標(biāo)改變，而可能只是遺傳信息小突變、丟失或易位，實(shí)際上，Jones（1974）已經(jīng)證實(shí)，在胡蘿卜培養(yǎng)物中，細(xì)胞群體在成胚能力上不穩(wěn)定性，可能是由用于建立該培養(yǎng)物組織帶來。在復(fù)雜多細(xì)胞外植體中，只有少數(shù)細(xì)胞能夠產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，其余細(xì)胞都是無法表示其全能性。按照這種假說，假如非胚性細(xì)胞類型在所用培養(yǎng)基中含有生長上選擇優(yōu)勢，在重復(fù)繼代培養(yǎng)中，非胚性細(xì)胞群體將會愛步增加，而胚性成份則逐步降低。到了一定時期之后，在培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細(xì)胞，這時若想再恢復(fù)它們胚胎發(fā)生能力就不可能了。然而，假如在培養(yǎng)物中存在少許胚性細(xì)胞，只是因?yàn)樘幱谥涞匚环桥咝约?xì)胞抑制作用，這些胚性細(xì)胞全能性無法表示，在這種情況下，經(jīng)過改變培養(yǎng)基成份，使之有選擇地促進(jìn)全能細(xì)胞增殖，就應(yīng)該有可能恢復(fù)該培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛力。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第16頁快速繁殖與脫毒培養(yǎng)

第一節(jié)

快速繁殖（微繁殖）

概念：所謂快速繁殖，就是得用組織培養(yǎng)方法，使植物部分器官、組織在人工控制適宜條件下，快速擴(kuò)大培養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出大量幼苗繁殖方法。特點(diǎn)：繁殖速度快；使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時省工；節(jié)約空間有利于植物工廠化生產(chǎn)；在無菌條件下進(jìn)行，不受病蟲害侵害。主要適合用于（1）加速一些難繁或繁殖速度低植物，尤其是一些珍稀名貴花卉，需要發(fā)展瀕危植物繁殖。（2）用有性繁殖方法難以保持品種特征異花授粉植物，如油棕、獼猴桃、非洲菊等。（3）需要去除病毒植物。（4）原種極少，生產(chǎn)上又急需推廣植物。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第17頁快速繁殖過程

快速繁殖過程普通包含四個階段，即無菌培養(yǎng)物建立、芽增殖、誘導(dǎo)生根和試管苗移植。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第18頁1．外植體選擇

選擇適當(dāng)外植體對于快速繁殖能否成功是極其主要，而選擇什么樣外植體首先決定于第二階段芽增殖所采取路徑。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第19頁經(jīng)過腋芽形成來增加芽數(shù)量時，應(yīng)從帶有營養(yǎng)芽部分得到外植體，并注意以下問題。（1）外植體大小，如為普通繁殖而非脫毒繁殖，可使用普通莖尖、芽或帶芽莖切段作為外植體。（2）取材植株生理狀態(tài)對培養(yǎng)成敗是極主要，普通在植物開始生長，芽已膨大但芽鱗片還未張開時最為適當(dāng)，此時芽生長旺盛，并有芽鱗片保護(hù)，不易污染。為了防止季節(jié)影響，在有條件時也能夠?qū)⒅参锓旁诠?、溫條件穩(wěn)定人工氣候箱或溫室中，使植物保持營養(yǎng)生長狀態(tài)，對一些需低溫或高溫或特殊光周期處理才能打破休眠塊莖、鱗莖、球莖等，常要處理后才可剝?nèi)∏o尖進(jìn)行培養(yǎng)。（3）芽在植物株上部位也是需要注意，在一些草本植物（如菊花等）中，使用頂芽或上部芽作為分生組織或莖尖培養(yǎng)時成功率常比側(cè)芽或基部芽要高，這可能和它們生長較旺盛有產(chǎn)。（4）多年生木本植物伴隨年紀(jì)增加，分生組織、莖尖和芽培養(yǎng)越困難，尤其是成年樹較幼態(tài)樹培養(yǎng)要困難得多，此時，常使用部分返幼階段或年紀(jì)較低根蘗苗或不定芽做材料，或采取一些辦法如將芽接在實(shí)生苗上，修剪、保持高水平水肥進(jìn)行營養(yǎng)繁殖，或用細(xì)胞分裂素噴灑植株方法等。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第20頁在經(jīng)過不定芽路徑使芽增殖時，能夠依據(jù)不一樣植物采取不一樣外植體，如根、莖、葉或花器官各部分，在自然界中能夠產(chǎn)生不定芽器官應(yīng)該首先被采取，如非洲紫羅蘭、秋海棠、大巖桐、落地生根等可用葉片，一些蘭花等能夠用莖尖；很各種植物，尤其是單子葉植物，能夠作用花器官，如黃花菜、鳶尾等。

在使用體細(xì)胞胚胎發(fā)生路徑時，常使用胚分生組織或生殖器官作為外植體

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第21頁2．外植體消毒

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第22頁（三）芽誘導(dǎo)及擴(kuò)大化繁殖（增殖）這是快繁技術(shù)中最主要性一環(huán)，在這一階段潛在植物體體（芽或胚狀體）經(jīng)過腋芽形成和生長、外植體或愈傷組織上不定芽形成和胚狀體發(fā)生三條件路徑在數(shù)量上得快速增殖，因?yàn)橥庵搀w種類不一樣，在增殖時可能采取路徑不一樣。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第23頁1．

促進(jìn)腋芽形成和生長

在高等植物每一個葉腋中通常都存在著腋芽，每一個腋芽在一定條件下都能生長并形成一個枝條，項(xiàng)端優(yōu)勢可抑制腋芽生長，使用外源細(xì)胞分裂素能夠打破頂端優(yōu)勢，促進(jìn)腋芽生長。在培養(yǎng)條件下，為了促使腋芽生長，需在培養(yǎng)基中加入一定濃度適當(dāng)種類細(xì)胞分裂素，有時同時可加入少許生長素以促進(jìn)腋芽生長（注意：生長素過多易造成愈傷化）。因?yàn)榧?xì)胞分裂素連續(xù)作用，腋芽生長成枝條，新產(chǎn)生枝條腋芽在細(xì)胞分裂素作用下又可生長，這么重復(fù)數(shù)次就能夠形成一叢嫩枝，將它們切割成帶有幾個芽小塊接種到一樣培養(yǎng)基上，這一過程又能重復(fù)進(jìn)行，這么就能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量芽。有些植物即使在含有細(xì)胞分裂素培養(yǎng)基中其項(xiàng)端優(yōu)勢也不易被打破，接種莖尖只能長成不分枝一根枝條，此時能夠用切段法（每個切段帶有一個腋芽）加以繁殖。用促進(jìn)腋芽生長方式進(jìn)行增殖時，普通速度較其它兩種方法要慢些，但每經(jīng)一個流程，嫩枝就以對數(shù)速度增加，而且因?yàn)榍o尖細(xì)胞是均一二倍體，又不易受環(huán)境條件影響而發(fā)生變異，所以遺傳穩(wěn)定性很好，適用這種方法繁殖植物種類也較多。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第24頁2．誘導(dǎo)不定芽形成

從現(xiàn)存芽之外任何組織器官上經(jīng)過器官發(fā)生行政機(jī)關(guān)后期怕芽稱為不定芽。經(jīng)過不定芽形成路徑進(jìn)行快繁，對于很多有貯藏器官植物如百合、風(fēng)信子等是很適當(dāng)，因?yàn)檫@些植物在自然條件下營養(yǎng)繁殖速度普通不太快，而它鱗片、葉基部或花梗等在培養(yǎng)時都輕易產(chǎn)生不定芽或小鱗莖或小球莖等不定器官，而且這一過程常可在試管中重復(fù)進(jìn)行。不定芽也能夠在愈傷組織上上產(chǎn)生，但假如經(jīng)過愈傷組織階段，尤其是屢次繼代愈傷組織，不但器官發(fā)生能力會逐步降低以至完全喪失，而且后代遺傳性不能穩(wěn)定，所以在快速繁殖中除少數(shù)作物外常不使用這種方法。對于不定芽形成，除特殊情況外，普通都要在培養(yǎng)基中同時加入適當(dāng)細(xì)胞分裂素和生長素。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第25頁3．誘導(dǎo)胚狀體形成

在自然界只有少數(shù)植物能夠經(jīng)過體細(xì)胞胚胎發(fā)生而產(chǎn)生胚狀體，但在培養(yǎng)條件下，現(xiàn)在已知有30多個科、150各種植物能夠產(chǎn)生胚狀體。誘導(dǎo)胚狀體時普通使用胚分生組織或生殖器官組織作為外植體。在一個含有豐富還原態(tài)氮基本培養(yǎng)基，在存在生長素，尤其是2，4-D時誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生，然后轉(zhuǎn)移到降低濃度呀?jīng)]有生長素培養(yǎng)基上使胚狀體成熟和生長。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第26頁經(jīng)過胚狀體發(fā)生路徑能夠在一個委小容器中產(chǎn)生比前兩種增殖方法高得多增殖速度，而且因?yàn)榕郀铙w是兩極性能夠免去誘導(dǎo)生根步驟，加上它輕易分散，能夠降低前兩種增殖方法中因分離、切割、接種所需消耗大量人力，有利于未來實(shí)施機(jī)械化操作。假如能夠控制好胚狀體發(fā)生和生長同時性，誘導(dǎo)休眠和制造人工種子技術(shù)無疑將是最理想快速繁方法，不過當(dāng)前除柑桔、棗椰、油棕和咖啡等少數(shù)作物外，這種方法使用并不普遍。這是因?yàn)楹芏嘀饕?jīng)濟(jì)作物還不能誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生或者產(chǎn)生胚狀體難以形成植株，或成苗率太低。另外遺傳性變異和由胚狀體形成植株返幼（多年生植物胚狀體長成植株和實(shí)生苗一樣要經(jīng)過一個幼年期才能開花結(jié)果）也是主要障礙。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第27頁器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第28頁（三）根誘導(dǎo)這一階段目標(biāo)是使第二階段經(jīng)過腋芽生長和不定芽形成路徑得到嫩枝生根產(chǎn)生小植株，方便移栽。很多草本植物不定根形成是很輕易，但木本植物普通要困難些，其中從成年樹得到材料就更困難。因?yàn)樯L嫩枝本身能全盛豐富生長素，所以一部分植物可在無激素培養(yǎng)基上生根。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第29頁1．剪下無根苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，試管苗生根，對基本培養(yǎng)基種類要求不嚴(yán)，如MS、B5、White等培養(yǎng)基，都可用于誘導(dǎo)生根，不過其含鹽濃度要適當(dāng)加以稀釋。前面幾個培養(yǎng)基中，除White外，都富含N，P，K鹽，它們都抑制根發(fā)生。所以，應(yīng)將它們降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低水平。生根培養(yǎng)基適當(dāng)加大生長素濃度，不用或少用細(xì)胞分裂素，生長素濃度在0.1-10mg/l，使用較多是NAA，其次為IAA和IBA，生長素濃度過高時輕易引發(fā)愈傷組織化和抑制根生長。培養(yǎng)基中蔗糖濃度降低到1.0-1.5%，以增強(qiáng)植株自養(yǎng)能力。培養(yǎng)基不宜過硬以免影響生根，可在培養(yǎng)基中加入1%左右活性碳，為提升小植株光合能力，可將光強(qiáng)度增加到3000-10000lux，光周期可用24小時光照或16小時，8小時黑暗以利于光形成建成。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第30頁2．對較難誘導(dǎo)生根植物，可先半無根苗浸泡在高濃度生長素（100mg/L）無菌水中幾小時到1天，用無菌水洗凈生長素后再接種到生根培養(yǎng)基。對薔薇科果樹如蘋果、梨等，可在生根培養(yǎng)基中加入適量根皮苷或根皮酚（間苯三酚）以促進(jìn)根形成，濃度約150mg/L，但也發(fā)覺對一個李樹而PG加入后反而抑制根形成，說明PG刺激效應(yīng)可能因基因型而不一樣。3．嫁接到根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)適當(dāng)砧木上，如三倍體西瓜苗接到瓠子上，在25-30℃、飽和濕度條件下，三天傷口長出愈傷，一周可成活。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第31頁（四）移栽

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第32頁植物無病毒苗培育

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第33頁一、病毒在植物上危害病毒危害給植物生產(chǎn)帶來損失是很大，如草莓病毒危害，使草莓產(chǎn)量嚴(yán)重降低，品質(zhì)大大退化。葡萄扇葉病毒使葡萄減產(chǎn)l0%-18%，為害馬鈴薯病蟲害則更多，大約有幾卜種，田此，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來嚴(yán)重障礙?；ɑ懿《疚：ζ胀〞绊懟ɑ苡^賞價值，其表現(xiàn)是花少而小，產(chǎn)生畸形、變色等。因?yàn)椴《緦χ参镌斐扇绱藝?yán)重危害。所以世界各國都開始重視這方面研究，如日本用柑桔莖尖微嫁接繁殖無病毒柑桔營養(yǎng)系。美國用組織培養(yǎng)法，使蘋果無病毒苗已工廠化育苗，并在各國普遍開展。二、無病毒苗培育意義用組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)無毒苗，是一個主動有效路徑，因?yàn)榕懦耸褂盟巹?，所以對降低污染，預(yù)防公害，保護(hù)環(huán)境都有主動意義。

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第34頁三、脫毒方法

（一）

熱處理脫毒器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第35頁1．熱處理法發(fā)覺及應(yīng)用熱處理又稱溫治療法(theomtherapy)，原理是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度環(huán)境中時，組織內(nèi)部病毒受熱之后部分或全部鈍化，在高溫下，不能生成或生成病毒極少，而破壞卻日趨嚴(yán)重，以致病毒含量不停降低，這么連續(xù)一段時間，病毒自行毀滅，從而到達(dá)脫毒目標(biāo)。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第36頁(1)溫湯浸漬處理

適合用于休眠器官、剪下接穗或種植材料，在50℃左右溫水中浸漬10min至數(shù)小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。(2)熱空氣處理

熱空氣處理對活躍生長莖尖效果很好，將生長盆栽植株移入溫?zé)嶂委熓?箱)內(nèi)，普通在35—40℃。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達(dá)數(shù)月。熱處理方法主要缺點(diǎn)是并非能脫除全部病毒，所以熱處理需與其它方法配合應(yīng)用，才可取得良好效果。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第37頁（二）莖尖培養(yǎng)脫毒

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第38頁1．莖尖培養(yǎng)脫毒原理感染病毒植株體內(nèi)病毒分布并不均勻，病毒數(shù)量隨植株部位及年紀(jì)而異，越靠近莖頂端區(qū)域病毒感染深度越低，生長點(diǎn)(約0.1～1.0mm區(qū)域)則幾乎不含或含病毒極少、這是因?yàn)榉稚鷧^(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能經(jīng)過胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不停分裂和活躍生長速度。在切取莖尖時越小越好，但太小則不易成活，過大又不能確保完全除去病毒。莖尖培養(yǎng)脫毒，因?yàn)槠涿摱拘Ч茫蟠€(wěn)定，所以是當(dāng)前培育無病毒苗最廣泛和最主要一個路徑。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第39頁莖尖培養(yǎng)方法在進(jìn)行脫毒培養(yǎng)時，因?yàn)槲⑿∏o尖組織極難靠肉眼操作，因而需用帶有適當(dāng)光源簡單解剖鏡(8—40倍)。除了在進(jìn)行植物組織無菌培養(yǎng)普通工具外，還需要一套解剖刀。剝離莖尖時，應(yīng)盡快接種，莖尖暴露時間應(yīng)該越短越好，以防莖尖變干。在切取外植體之前普通須對莖芽進(jìn)行表面消毒。葉片包被嚴(yán)緊芽，如菊花、蘭花，只須在75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被渙散芽，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。將接處好莖尖置于22℃左右溫度下。天天以16h—30001x光照條件下培養(yǎng)。因?yàn)樵诘蜏睾投倘照障拢o尖有可能進(jìn)入休眠；所以較高溫度和充分日照時間必須確保。微莖尖需數(shù)月培養(yǎng)才能成功。

莖尖培養(yǎng)繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和普通器官培養(yǎng)相同

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第40頁（三）

其它路徑脫毒1。愈傷組織培養(yǎng)脫毒經(jīng)過植物器官和組織培養(yǎng)去分分誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長成小植株，能夠得到無病毒苗。2．莖尖微體嫁接

木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實(shí)生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.4—1.0mm莖尖，在砧木上進(jìn)行試管微體嫁接，以取得無病毒幼苗。許多化學(xué)藥品(包含嘌呤、嘧啶類似物、氨基酸、抗菌素等)對離體組織和原生質(zhì)體含有脫毒效果。慣用藥品有：8—氮鳥嘌呤、2—硫脲嘧啶、殺稻瘟抗菌素、放線菌素D、慶大霉素等。比如，將100μg2—硫脲嘧啶加入培養(yǎng)基可除去煙草愈傷組織中PVY(馬鈴薯病毒)。器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第41頁四．

病毒植物判定

器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生專家講座第42頁（一）指示植物(indmatingplant)法

利用病毒在其它植物上產(chǎn)生枯斑作為判別病毒種類方法，就是枯斑和空斑測定法。這種專門選取以產(chǎn)生局部病斑寄主即為指示植物，又稱判別寄主。它只能判定靠汁液傳染病毒。

指示植物法最早是美國病毒學(xué)家Holmes1929年發(fā)覺。他用感染TMV昔通煙葉粗汁液和少許金剛砂相混合，然后在煙葉子上摩擦2—3d后葉片止出現(xiàn)了局部壞死斑。在一定范圍內(nèi)，枯斑與侵染性病毒濃度成正比。這種方法條件簡單，操作方便，故一直沿用至今，仍為一個經(jīng)濟(jì)而有效判定方法。枯斑法不能測出病毒總核蛋白濃度，而只能測出病毒相對感染力。

因?yàn)椴《炯纳秶灰粯?，所以?yīng)依據(jù)不一樣病毒選擇適合指示植物。另外還要求所選擇指示植物不但一年四季都輕易栽培，而且在較長時期內(nèi)還能保持對病毒敏感性和輕易接種，而且在較廣范圍內(nèi)含有一樣反應(yīng)。指示植物普通有兩種類型：一個是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，其病毒可擴(kuò)展到植物非接種部位，通常沒有局部病斑；另一個是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)狀病斑組成。木本多年生果樹植物及草莓等無性繁殖草本植物用汁液