大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座

大腸桿菌基因工程—人胰島素生產講述人599小組組員.11.7大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第1頁目錄1.利用重組大腸桿菌生產醫(yī)用蛋白或多肽2.胰島素生產方法3.產人胰島素大腸桿菌工程菌構建策略大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第2頁利用重組大腸桿菌生產醫(yī)用蛋白或多肽因為大腸桿菌繁殖快速價格低廉，培養(yǎng)代謝易于控制，所以重組大腸桿菌在醫(yī)用蛋白大規(guī)模生產中含有主要經(jīng)濟意義。盡管有些生物活性嚴格依賴于糖基化作用真核生物功效蛋白無法用重組大腸桿菌進行生產，蛋白質生物合成后加工系統(tǒng)缺乏使得一些人體蛋白難以折整天然構象，但仍有100各種異源蛋白經(jīng)過大腸桿菌基因工程菌實現(xiàn)了產業(yè)化，其中包含一些結構相當復雜人體蛋白，如富含半胱氨酸血清清蛋白（HSA）、尿激酶原（pro-UK）、金屬硫蛋白（MT）、二硫鍵共價交聯(lián)二聚體蛋白巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）以及四聚體血紅蛋白(Hb）等。此次以重組人胰島素為例，敘述利用大腸桿菌生產外源基因表示產物基本過程。大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第3頁胰島素生產方法

人胰島素是一個由兩條多肽鏈(A鏈和B鏈)組成蛋白質。胰島素合成時，最初在胰島B細胞內附著核糖體上形成是一條單鏈多肽———前胰島素原，其進入內質網(wǎng)腔后，信號肽酶切除信號肽形成胰島素原，后者被運輸至高爾基體，在高爾基體中切除連接序列(C鏈)形成A鏈和B鏈，然后經(jīng)過二硫鍵將二者結合形成有生物活性胰島素。

工業(yè)上可采取以下四種方法大規(guī)模生產人胰島素：（1）從人胰中直接提取胰島素；（2）由單個氨基酸直接化學合成；（3）由豬胰島素化學轉型為人胰島素；（4）利用基因工程菌大規(guī)模大規(guī)模發(fā)酵生產重組人胰島素。大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第4頁產人胰島素大腸桿菌工程菌構建策略大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第5頁1

A鏈和B鏈編碼區(qū)由化學合成，兩個雙鏈DNA片段分別克隆在含有Ptac開啟子和β-半乳糖苷酶基因表示型質粒上，后者與胰島素編碼序列形成雜合基因，其連接位點處為甲硫氨酸密碼子。重組分子分別轉化大腸桿菌受體細胞，兩種克隆菌分別合成β-半乳糖苷酶-人胰島素A鏈以及β-半乳糖苷酶-人胰島素B鏈兩種融合蛋白。經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵后，從菌體中分離純化融合蛋白，再用溴化氫在甲硫氨酸殘基C端化學切斷融合蛋白，釋放出人胰島素A鏈和B鏈。胰島素AB鏈分別表示法基本原理AB鏈分別表示法大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第6頁2人胰島素原表示法即使上述工藝路線并不比AB鏈分別表示更為簡捷，而且需要額外使用兩種高純度酶制劑，但因為其體外折疊成功率相當高，在一定程度上填補了工藝繁瑣缺點，使得產品生產成本僅為50美元/g。

將人胰島素原cDNA編碼序列克隆在β-半乳糖苷酶基因下游，兩個DNA片段連接處仍為甲硫氨酸密碼子。該雜合基因在大腸桿菌中高效表示后，分離純化融合蛋白，并一樣采取溴化氫化學裂解法回收人胰島素原片段，然后將之進行體外折疊。因為C肽存在，胰島素原在復性條件下能形整天然空間構象，為3對二硫鍵正確配對提供了良好條件，使得體外折疊率高達80%以上。為了取得含有生物活性胰島素，經(jīng)折疊后人胰島素原分子必須用胰蛋白酶特異性切除C肽，可取得完整A鏈以及C端帶有精氨酸ArgB鏈。大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第7頁AB鏈同時表示法

這種方法基本思緒是將人胰島素A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因下游。重組子表示出融合蛋白經(jīng)溴化氫CNBr處理后，分離傳話A-B鏈多肽，然后再依據(jù)兩條鏈連接處氨基酸性質，采取對應裂解方法取得A鏈和B鏈肽段，最終經(jīng)過體外折疊制備含有活性重組人胰島素。與第一個方法相同，其最大缺點仍是體外折疊正確率較低，所以當前還未進入應用階段。3大腸桿菌基因工程人胰島素專家講座第8頁

上述三種工程菌構建路線均采取胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因拼接方法，所生產融合型重組蛋白表示率高，且穩(wěn)定性強，但不能分泌，主要以包含體形式存在與細胞內。一個能促進融合蛋白分泌工程菌構建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列插入到表示型質粒β-內酰胺酶基因下游，后者所編碼是降解青霉素酶蛋白，通常能被大腸