基因工程原理與技術(shù)

基因工程原理與技術(shù)基因工程原理與技術(shù)第1頁第一章緒論第一節(jié)基因工程概念基因工程(geneengineering)是當(dāng)代生物技術(shù)關(guān)鍵內(nèi)容。

基因工程是在分子水平上進(jìn)行遺傳操作，是指將一個(gè)或各種生物體基因分離出來或人工合成基因，按照大家愿望，進(jìn)行嚴(yán)密設(shè)計(jì)和體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)生物體細(xì)胞內(nèi)，使之能在受體細(xì)胞中遺傳表示并取得新遺傳性狀而形成新生物類型生物技術(shù)。

基因工程關(guān)鍵內(nèi)容是基因體外重組(DNA體外重組)?；蚬こ趟拇笠?或基礎(chǔ)條件)：目標(biāo)基因、載體、工具酶、受體。

相關(guān)名詞：遺傳工程、基因工程、基因操作、重組DNA技術(shù)、分子克隆、基因克隆、基因無性繁殖?；蚬こ掏怀鎏攸c(diǎn)：打破物種間基因交流界限。

基因工程原理與技術(shù)第2頁第二節(jié)基因工程誕生與發(fā)展

基因工程誕生于1973年。一、基因工程誕生理論和技術(shù)基礎(chǔ)1、理論基礎(chǔ)

①DNA是遺傳物質(zhì)；

②DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制；

③遺傳密碼通用性和遺傳信息傳遞方式。2、技術(shù)基礎(chǔ)

①限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)覺與DNA切割；

②DNA連接酶發(fā)覺與DNA片段連接；

③基因工程載體構(gòu)建與應(yīng)用。

基因工程原理與技術(shù)第3頁二、基因工程誕生

1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg研究小組DNA體外重組試驗(yàn)。

1973年，斯坦福大學(xué)S.Cohen研究小組DNA體外重組和大腸桿菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。(見下兩張幻燈片)

同年，加利福尼亞大學(xué)H.Boyer也進(jìn)行了類似試驗(yàn)。這一試驗(yàn)成功標(biāo)志著基因工程誕生，所以，1973年被定為基因工程誕生元年。

基因工程原理與技術(shù)第4頁pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因基因工程原理與技術(shù)第5頁培養(yǎng)平皿

卡那霉素平板四環(huán)素\卡那霉素平板大腸桿菌四環(huán)素平板基因工程原理與技術(shù)第6頁三、基因工程發(fā)展

分為艱難階段、逐步成熟階段、快速發(fā)展階段、鼎盛發(fā)展階段。1、基因工程艱難階段(1973~1976，載體和受體系統(tǒng)安全性改造)

基因工程安全性問題，造成許多國家限制基因重組試驗(yàn)。2、基因工程逐步成熟階段(1976~1982，基因工程藥品研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)企業(yè)成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先將人工合成生長激素釋放抑制因子14肽基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽(見下列圖)；

1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表示成功；

1979年美國基因技術(shù)企業(yè)用人工合成人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并經(jīng)過發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素。從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化序幕。

基因工程原理與技術(shù)第7頁大腸桿菌生長激素釋放抑制因子重組體+SS基因目標(biāo)基因基因載體從動(dòng)物腦中提取5mg---50萬只羊腦9升工程大腸桿菌培養(yǎng)液基因工程原理與技術(shù)第8頁3、基因工程快速發(fā)展階段(1982~，動(dòng)植物基因工程育種與基因治療)

發(fā)展了一系列新基因工程操作技術(shù)，構(gòu)建了各種轉(zhuǎn)化原核生物和動(dòng)物、植物細(xì)胞載體。

1982年首次經(jīng)過顯微注射培育出世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物——轉(zhuǎn)基因小鼠。

1983年采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因煙草。

1990年美國政府首次同意一項(xiàng)人體基因治療臨床研究計(jì)劃，對(duì)一名因腺苷脫氨酶基因缺點(diǎn)而患有重度聯(lián)合免疫缺點(diǎn)癥兒童進(jìn)行基因治療取得成功。

1991年，美國提出人類基因組計(jì)劃并實(shí)施?；蚬こ淘砼c技術(shù)第9頁4、鼎盛發(fā)展階段(21世紀(jì))

年完成人類基因組計(jì)劃。至今，基因工程藥品上市有幾十種，上百種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

轉(zhuǎn)基因植物快速發(fā)展，當(dāng)前最少有150種轉(zhuǎn)基因植物問世。自從1986年抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草被首次同意進(jìn)入田間試驗(yàn)以來,至今國際上已經(jīng)有30個(gè)國家同意上千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn),包括植物種類達(dá)50各種。自從1994年轉(zhuǎn)基因延熟西紅柿獲準(zhǔn)上市以來，當(dāng)前最少有51種轉(zhuǎn)基因植物上市。

基因工程原理與技術(shù)第10頁

即使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物誕生早，但其發(fā)展比轉(zhuǎn)基因植物要慢得多！主要原因是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作煩瑣、困難，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要求高，不易再生出個(gè)體。荷蘭GenPharm企業(yè)用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)乳鐵蛋白，預(yù)計(jì)每年從牛奶生產(chǎn)出來營養(yǎng)奶粉銷售額是50億美元。基因工程原理與技術(shù)第11頁

英國羅斯林研究所研制成功轉(zhuǎn)基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治療肺氣腫病。這種病在北美比較常見，病人以前只能依賴于注射人α[1]-抗胰蛋白酶做替換療法，價(jià)格昂貴，而現(xiàn)在用轉(zhuǎn)基因羊來生產(chǎn)，每升這種羊奶可售6000美元?；蚬こ淘砼c技術(shù)第12頁

中國工程院院士曾溢濤教授研究小組取得5只轉(zhuǎn)基因山羊。其中一只奶山羊乳汁中，含有堪稱血友病人救星藥品蛋白——有活性人凝血因子Ⅸ。

基因工程原理與技術(shù)第13頁第三節(jié)基因工程研究主要內(nèi)容一、基因工程研究主要內(nèi)容主要包含：基礎(chǔ)研究（載體研究、受體系統(tǒng)研究、目標(biāo)基因研究、工具酶研究、轉(zhuǎn)化方法研究、生物基因組學(xué)研究）和應(yīng)用研究等。1、載體研究構(gòu)建各種用途載體及提升外源基因表示效率。2、受體系統(tǒng)研究

包含細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物。

受體系統(tǒng)安全性及轉(zhuǎn)化效率。3、目標(biāo)基因研究目標(biāo)基因分離、克隆及改造。

基因工程原理與技術(shù)第14頁4、工具酶研究開發(fā)新工具酶。5、轉(zhuǎn)化方法研究開發(fā)各種受體細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化方法。6、生物基因組學(xué)研究含有主要經(jīng)濟(jì)價(jià)值各種生物基因組測序、挖掘新基因等。7、應(yīng)用研究

包含基因工程藥品研究、基因疫苗研究、轉(zhuǎn)基因植物研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究以及在酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學(xué)與能源工業(yè)及環(huán)境保護(hù)等方面應(yīng)用。

基因工程原理與技術(shù)第15頁二、基因工程基礎(chǔ)操作程序

①分離取得帶有目標(biāo)基因DNA片段及載體選擇與構(gòu)建。

②限制性核酸內(nèi)切酶分別切割外源DNA和載體。

③經(jīng)過DNA連接酶將外源基因DNA片段連接到載體上，形成重組DNA分子。

④將重組DNA分子引入到受體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化)。

⑤帶有重組體細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)擴(kuò)增及選擇培養(yǎng)。

⑥轉(zhuǎn)化體判定，取得外源基因高效穩(wěn)定表示基因工程菌或細(xì)胞。⑦目標(biāo)基因深入研究分析，并設(shè)法使之實(shí)現(xiàn)功效蛋白表示(基因功效研究或基因改造研究)。

基因工程原理與技術(shù)第16頁基因工程原理與技術(shù)第17頁三、基因工程基礎(chǔ)操作內(nèi)容基因工程主體戰(zhàn)略思想是外源基因穩(wěn)定高效表示。為到達(dá)此目標(biāo)，可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行操作。

①選取高拷貝載體，增加外源基因在受體細(xì)胞中劑量；②篩選、修飾和重組開啟子、增強(qiáng)子、終止子等基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并將這些元件與外源基因精細(xì)拼接，強(qiáng)化外源基因轉(zhuǎn)錄水平。③選擇、修飾和重組核糖體結(jié)合位點(diǎn)及密碼子等mRNA翻譯調(diào)控元件，強(qiáng)化受體細(xì)胞中蛋白質(zhì)生物合成過程。

④構(gòu)建融合表示載體或分泌表示載體，增加外源蛋白可溶性。

基因工程原理與技術(shù)第18頁第四節(jié)基因工程意義與發(fā)展前景一、基因工程研究意義①大規(guī)模生產(chǎn)其它生物體內(nèi)含量極微但卻含有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值生物分子；②設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種(新性狀乃至全新物種

)；③搜尋、分離和判定生物體尤其是人體內(nèi)遺傳信息資源(基因)。二、基因工程發(fā)展前景基因工程問世以來短短三十年，顯示出了巨大活力，基因工程前景將愈加燦爛輝煌。今后，基因工程重點(diǎn)研究方向是基因組學(xué)、基因工程藥品、動(dòng)植物生物反應(yīng)器和環(huán)境保護(hù)等方面。

基因工程原理與技術(shù)第19頁第二章基因工程工具酶

工具酶是指基因工程操作中所使用核酸酶類。依據(jù)其用途分為四類：限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶、修飾酶。第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶一、宿主限制-修飾現(xiàn)象(見下列圖)

限制作用(restriction)：指一定類型細(xì)菌能夠經(jīng)過限制酶作用，破壞入侵噬菌體DNA，造成噬菌體寄主幅度受到限制。這是維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定保護(hù)機(jī)制。

修飾作用(modification)：指寄主本身DNA，因?yàn)樵诤铣珊蠼?jīng)過甲基化酶作用得以甲基化，使DNA得以修飾，從而免遭本身限制性酶破壞。這是宿主細(xì)胞識(shí)別本身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)作用機(jī)制?；蚬こ淘砼c技術(shù)第20頁R/M系統(tǒng)①DNA甲基化酶②限制性核酸內(nèi)切酶R/M系統(tǒng)作用①限制作用②修飾作用基因工程原理與技術(shù)第21頁1953年，Arber發(fā)覺限制-修飾現(xiàn)象，預(yù)見限制性核酸內(nèi)切酶存在；

1970年，H.O.Smith從流感嗜血桿菌中分離出第一個(gè)II型限制性核酸內(nèi)切酶HindII。

Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA?；蚬こ淘砼c技術(shù)第22頁基因工程原理與技術(shù)第23頁

依據(jù)限制-修飾系統(tǒng)遺傳分析，大腸桿菌K12有以下4種表型：①rk+mk+：野生型，含有完整限制和修飾功效。②rk-mk+：限制缺點(diǎn)型，不能降解外源DNA，但含有修飾功效，這類突變株經(jīng)常見于基因工程受體。③rk-mk-：限制和修飾缺點(diǎn)型，既無限制功效，又無修飾功效，也常見于基因工程受體。④rk+mk-：修飾缺點(diǎn)型，缺乏修飾本身DNA功效，但含有限制功效，故也稱為“自殺性表型”(suicidephenotype)?；蚬こ淘砼c技術(shù)第24頁二、限制性核酸內(nèi)切酶類型

限制性核酸內(nèi)切酶是指一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA核酸內(nèi)切酶。

簡稱限制性內(nèi)切酶或限制性酶，當(dāng)前已經(jīng)判定出三種不一樣類型。至今，已發(fā)覺近4000種限制酶。特征Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子結(jié)構(gòu)功效輔助因子識(shí)別序列切割位點(diǎn)切割方式應(yīng)用價(jià)值舉例異源三聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱序列距識(shí)別序列1kb處隨機(jī)性切割無EcoK、EcoB同源三聚體限制Mg2+

4-6bp回文序列識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割廣泛EcoRI、HindIII…異源二聚體限制與修飾ATPMg2+SAM非對(duì)稱序列識(shí)別序列下游24-26bp處隨機(jī)性切割小EcoPI基因工程原理與技術(shù)第25頁三、限制性核酸內(nèi)切酶命名

1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系統(tǒng)，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改。①限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母(大寫，斜體)代表該酶宿主菌屬名(genus)第一個(gè)字母；第二、三個(gè)字母(小寫，斜體)代表宿主菌種名(species)前兩個(gè)字母。②第四個(gè)字母代表宿主菌菌株名第一個(gè)字母(小寫，正體)或染色體外成份(質(zhì)?；蚴删w，大寫，正體)。③若從一個(gè)菌株中發(fā)覺了幾個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶，即依據(jù)發(fā)覺和分離先后次序用羅馬字母表示(正體)。

Haemophilusinfluenzae

d

流感嗜血桿菌d株

HindⅡ

HindⅢ基因工程原理與技術(shù)第26頁四、II型限制性核酸內(nèi)切酶基礎(chǔ)特征1、II型限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列

普通為4～6bp回文序列。也有6bp以上，如NotI，稱為稀有切割限制酶。有些為反向重復(fù)序列(間斷回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶識(shí)別序列中，某一位或二位堿基并非嚴(yán)格專一，如HindII可識(shí)別4種核苷酸序列。

酶識(shí)別序列酶識(shí)別序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG基因工程原理與技術(shù)第27頁2、II型限制性核酸內(nèi)切酶切割方式大多數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶均在其識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中3’位酯鍵，產(chǎn)生3’端為羥基、5’端為磷酸基團(tuán)片段。有三種切割方式：①在識(shí)別序列對(duì)稱軸5’末端切割，產(chǎn)生5’黏性末端，如EcoRI基因工程原理與技術(shù)第28頁②在識(shí)別序列對(duì)稱軸3’端切割，則產(chǎn)生3’黏性末端，如PstI基因工程原理與技術(shù)第29頁③在識(shí)別序列對(duì)稱軸上切割，產(chǎn)生平頭末端，如PvuII

有些識(shí)別序列為間斷型回文序列II限制酶，其切點(diǎn)位于不確定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGC

SfiIGGCCNNNNN↓NGGCC

XmnIGAANN↓NNTTC基因工程原理與技術(shù)第30頁

有極少數(shù)II型限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離識(shí)別序列，如MboII識(shí)別GAAGA序列，切割位點(diǎn)則是：

5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’

同裂酶是指識(shí)別序列相同、切割方式相同或不一樣、起源不一樣II限制性核酸內(nèi)切酶。如：HpaII與MspI識(shí)別序列和切割位點(diǎn)都相同(C↓CGG)，但MspI還能夠識(shí)別已甲基化序列CmCGG；

SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，識(shí)別序列相同，但切割位點(diǎn)不一樣?；蚬こ淘砼c技術(shù)第31頁

同尾酶是指起源各異、識(shí)別序列不一樣，但產(chǎn)生相同黏性末端II限制性核酸內(nèi)切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)

BglII(5’-A↓GATCT-3’)3、II型限制性核酸內(nèi)功酶不含有甲基化功效如EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶與EcoRI甲基化酶，二者均識(shí)別GAATTC序列，而前者能對(duì)G↓AATTC序列進(jìn)行切割，后者作用是使第二個(gè)A甲基化。當(dāng)前已經(jīng)分離到許多II型限制性核酸內(nèi)切酶與其對(duì)應(yīng)甲基化酶。基因工程原理與技術(shù)第32頁4、II型限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA切割有一些II限制性核酸內(nèi)切酶，除雙鏈DNA外，還能夠特異識(shí)別并切割單鏈DNA對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，只是切割效率比較低。如HhaI能切割單鏈?zhǔn)删wФX174和M13mp18DNA，只是切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率低50％。五、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶主要用途①產(chǎn)生含有相同粘性末端DNA片段，方便重組克隆；②建立DNA分子限制酶圖譜；③構(gòu)建基因文庫；④構(gòu)建載體?；蚬こ淘砼c技術(shù)第33頁六、II型限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)1、標(biāo)準(zhǔn)酶解體系建立

反應(yīng)體積普通為20μl(依據(jù)DNA量可適當(dāng)擴(kuò)充)。

①10×酶切緩沖液

2μl(大個(gè)別酶反應(yīng)緩沖液基礎(chǔ)相同：

50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(依據(jù)酶活力大小及工作性質(zhì)確定酶量，不超出反應(yīng)總體積10％

③DNA樣品(μ

g~mg)④無菌水

限制性核酸內(nèi)切酶一個(gè)活力單位(U)為：在適當(dāng)溫度和緩沖液中，在20μ

L反應(yīng)體系中，1h完全降解1ug標(biāo)準(zhǔn)DNA所需要酶量?；蚬こ淘砼c技術(shù)第34頁2、酶解反應(yīng)①混勻②酶解(溫度、時(shí)間)③酶解判定④終止a、加EDTA至10mmol/L；

b、加SDS至0.1%(W/V)；

c、65℃水浴保溫20min(有些最適反應(yīng)溫度較高酶不能使之完全失活，如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；

d、酚/氯仿抽提酶，乙醇沉淀DNA

3、限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA不完全酶解(見下列圖)

不完全酶解對(duì)于構(gòu)建物理圖譜和基因組文庫是非常必要。其方法有降低酶量、增加反應(yīng)體積、縮短反應(yīng)時(shí)間和降低反應(yīng)溫度等。

基因工程原理與技術(shù)第35頁incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+3基因工程原理與技術(shù)第36頁4、Ⅱ限制性核酸內(nèi)切酶操作注意事項(xiàng)①商品化限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時(shí)應(yīng)使用新吸頭去取酶；②加入酶體積應(yīng)不超出總體積10%，不然酶液中甘油濃度超出5%時(shí)將會(huì)抑制酶活性；③整個(gè)操作應(yīng)在0℃進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最終加入酶；④盡可能使反應(yīng)體積減到最小，即盡可能少加水；⑤當(dāng)切割大量DNA時(shí)，通常采取延長反應(yīng)時(shí)間，降低酶用量；⑥當(dāng)DNA需2種或以上酶切時(shí)，應(yīng)用通用緩沖液。若沒有通用緩沖液時(shí)，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個(gè)酶切反應(yīng)?；蚬こ淘砼c技術(shù)第37頁七、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性與酶切效果原因

1、酶純度；要求不存在其它核酸內(nèi)切酶或外切酶污染。

2、DNA樣品純度；

DNA樣品中蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。樣品中DNase會(huì)降解DNA，影響酶切。3、酶切反應(yīng)溫度、時(shí)間；多數(shù)II型限制酶最適反應(yīng)溫度是37℃，但SmaI為25℃或30℃，SfiI為50℃，TaqI為65℃

。反應(yīng)溫度過高或過低都會(huì)影響酶活性，甚至造成酶失活?；蚬こ淘砼c技術(shù)第38頁4、DNA甲基化程度；限制性核酸內(nèi)切酶不能切割甲基化核苷酸序列。這一特征有特殊用途：①改變一些限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列；②產(chǎn)生新限制酶識(shí)別序列；③保護(hù)限制性核酸內(nèi)切酶切點(diǎn)；④利用一些同裂酶對(duì)甲基化敏感性不一樣，研究細(xì)胞DNA位點(diǎn)專一性甲基化程度和分布。

大腸桿菌中DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響。大腸桿菌中DNA胞嘧啶甲基化酶

(dcm)在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響酶有EcoRII等，但BglI、KpnI不受影響。采取去甲基化酶大腸桿菌菌株來制備質(zhì)粒DNA，可預(yù)防DNA甲基化?；蚬こ淘砼c技術(shù)第39頁5、DNA分子構(gòu)型

限制性內(nèi)切酶對(duì)不一樣構(gòu)型DNA分子酶切效果是不一樣，比如超螺旋DNA酶解所需要酶量，比線性DNA酶解所需要酶量高許多，甚至可高達(dá)20倍。有些限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)于同一DNA分子上不一樣位置識(shí)別序列，切割效率顯著不一樣。比如，EcoR

I、HindIII對(duì)λDNA酶切。6、反應(yīng)緩沖液主要成份：pH(Tris-HCl)、離子強(qiáng)度(NaCl)、Mg2+；

輔助成份：β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)預(yù)防酶氧化；

牛血清蛋白(BSA)組分V對(duì)于一些酶是必需，可預(yù)防酶在低濃度蛋白質(zhì)溶液中變性?；蚬こ淘砼c技術(shù)第40頁

星號(hào)活性是指在極端非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，限制性核酸內(nèi)切酶能切割與特異識(shí)別序列相同序列特征。

比如EcoRI在高pH(＞8)、低鹽(50mmol/L)和高濃度甘油(＞5％)存在情況下，其識(shí)別序列由GAATTC改變?yōu)镹AATTN。以EcoRI

表示其星號(hào)活性。

引發(fā)星號(hào)活性原因有：①高甘油含量，大于5%；②酶用量過大，大于100U/微克DNA；③低離子強(qiáng)度，小于25mmol/L；④高pH，大于8.0；⑤含有機(jī)劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙酰胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+二價(jià)陽離子存在。常發(fā)生星活性內(nèi)切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等?；蚬こ淘砼c技術(shù)第41頁第二節(jié)DNA連接酶

1967年幾個(gè)試驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)覺DNA連接酶。一、定義與反應(yīng)機(jī)理

DNA連接酶是指能催化雙鏈DNA分子內(nèi)或分子間5’-磷酸基和3’-羥基生成磷酸二酯鍵而使DNA鏈連接一類酶。大腸桿菌和其它細(xì)菌：NAD+動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體：ATP基因工程原理與技術(shù)第42頁T4DNA連接酶連接DNA/RNA雜合分子中DNA鏈切口DNA連接酶無連接基因工程原理與技術(shù)第43頁DNA連接酶作用機(jī)理基因工程原理與技術(shù)第44頁二、DNA連接酶種類1、T4噬菌體DNA連接酶(T4DNA連接酶)

T4DNA連接酶DNA/RNARNA

平頭末端Km比黏性末端Km高約1000倍。提升平頭末端連接效率方法：①加大酶濃度(10~100倍于粘性末端)；②加大底物濃度；③加入適量一價(jià)陽離子(150-200mmol/LNaCl)；④加入低濃度PEG(10%PEG8000)。ATP最適終濃度為0.5mmol/L?；蚬こ淘砼c技術(shù)第45頁2、大腸桿菌DNA連接酶

E.coliDNA連接酶DNA/RNAE.coliDNA連接酶無連接3、T4噬菌體RNA連接酶

用途：RNA末端標(biāo)識(shí)pNpNNNNT4RNA連接酶基因工程原理與技術(shù)第46頁三、DNA連接酶反應(yīng)體系

DNA連接酶活性單位較通用是韋氏(Weiss)單位，一個(gè)韋氏單位是指在37℃，20min內(nèi)催化從γ,β-32P-ATP焦磷酸根置換出1nmol32P所需要酶量。

M-L單位：以d(A-T)n作為底物黏性末端連接單位：以λDNA/HindIII片段為底物一個(gè)韋氏單位相當(dāng)于0.2個(gè)M-L單位或者60個(gè)黏性末端連接單位。

反應(yīng)體系：10μL或20μL，DNA片段，連接酶，Buffer，溫度(12~16℃或<30℃)，時(shí)間(4~16h)

Buffer：50mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/LATP，5mmol/LDTT基因工程原理與技術(shù)第47頁四、影響連接反應(yīng)原因1、DNA末端濃度連接產(chǎn)物分子構(gòu)型(線形或環(huán)狀)與DNA濃度及DNA分子長度存在親密關(guān)系。在一定濃度下，小分子DNA片段進(jìn)行分子內(nèi)連接，有利于形成環(huán)化分子。對(duì)于長度一定DNA分子，其濃度增加有利于分子間連接。另外，分子間連接還與兩種片段末端濃度百分比相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)上一個(gè)片段濃度大于另一一個(gè)片段濃，如：在克隆中，插入片段:載體片段=2:1。2、反應(yīng)溫度

介于最適溫度與其Tm之間。＞30℃會(huì)造成T4DNA連接酶不穩(wěn)定。

3、ATP濃度

ATP最適終濃度為0.5mmol/L，濃度過高會(huì)抑制連接?；蚬こ淘砼c技術(shù)第48頁第三節(jié)DNA聚合酶

DNA聚合酶分為：①依賴于DNADNA聚合酶；②依賴于RNADNA聚合酶。常見DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I、Klenow片段酶、T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶。酶聚合反應(yīng)速度5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性連續(xù)合成能力E.ColiDNA聚合酶I中速有低低Klenow酶中速無低低T4DNA聚合酶中速無高低T7DNA聚合酶快速無高高修飾T7DNA聚合酶快速無低或無高TaqDNA聚合酶快速有無高逆轉(zhuǎn)錄酶低速無無中基因工程原理與技術(shù)第49頁一、大腸桿菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性：雙鏈DNA帶磷酸基團(tuán)5’端或

DNA/RNA雜合分子中RNA5’端3’→5’外切酶活性切口平移作用DNAPolI基因工程原理與技術(shù)第50頁主要用途：切口平移法制備DNA探針反應(yīng)體系：在25μl反應(yīng)體系中含有1μg純化特定DNA片斷，并加入適量DNaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未標(biāo)識(shí)dNTPs。

DNaseI，Mg2+PolI，α-32p-dCTP，dNTPs基因工程原理與技術(shù)第51頁二、Klenow片段

Klenow酶含有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺失5`→3`核酸外切酶活性。其主要用途以下：①補(bǔ)平限制性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生5’黏性末端；

基因工程原理與技術(shù)第52頁②標(biāo)識(shí)3’凹陷末端DNA分子或平末端；

DNA末端標(biāo)識(shí)普通標(biāo)識(shí)活性不高，極少用于分子雜交探針標(biāo)識(shí)，主要用于DNA序列測定等所需片段標(biāo)識(shí)。

基因工程原理與技術(shù)第53頁③合成cDNA第二鏈；④雙脫氧末端終止法測定DNA序列；⑤在單鏈模板上延伸寡核苷酸引物，以合成雜交探針和進(jìn)行體外突變。

平末端標(biāo)識(shí)基因工程原理與技術(shù)第54頁三、T4噬菌體DNA聚合酶

含有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，缺乏5’→3’外切酶活性。其3’→5’外切酶活性比Klenow酶高100~1000倍。

在無dNTP時(shí)，能夠從任何3`-OH端外切(即可降解dsDNA，只是其活性比ssDNA低很多)，在只有一個(gè)dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸，在四種dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。T4DNA聚合酶置換合成作用無dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶基因工程原理與技術(shù)第55頁T4DNA聚合酶用途：①切平核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生3’黏性末端基因工程原理與技術(shù)第56頁②末端標(biāo)識(shí)。尤其是不需要核酸外切酶幫助就可進(jìn)行平末端標(biāo)識(shí)，這種探針標(biāo)識(shí)方法稱為置換(取代)合成法。

置換合成法將產(chǎn)生一組末端完全標(biāo)識(shí)、而從末端到中點(diǎn)其標(biāo)識(shí)量遞減分子。

基因工程原理與技術(shù)第57頁四、T7噬菌體DNA聚合酶與測序酶

T7DNA聚合酶含有5`→3`聚合酶活性及很強(qiáng)單鏈、雙鏈DNA3`→5`外切酶活性，但無5`→3`外切酶活性。其最大特點(diǎn)是有最強(qiáng)連續(xù)合成能力。其用途以下：

①用于長模板(M13DNA)引物延伸；(不受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響，聚合能力較強(qiáng)可延伸合成數(shù)千個(gè)核苷酸)②經(jīng)過延伸或取代合成法標(biāo)識(shí)DNA3’末端；

③將雙鏈DNA5’或3’突出末端轉(zhuǎn)變成平末端結(jié)構(gòu)。對(duì)天然T7DNA聚合酶進(jìn)行修飾，使之降低或完全失去3’→5’外切酶活性，而聚合酶活性增加了3倍。所以，修飾T7DNA聚合酶主要用于雙脫氧測序，又稱作為測序酶。另外，還用于末端標(biāo)識(shí)、探針制備(可催化較低水平<0.1μmol/LdNTP參入)、體外誘變中DNA鏈合成。

基因工程原理與技術(shù)第58頁五、TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶含有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。其最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定(95℃以上高溫半小時(shí)不失活)，最適反應(yīng)溫度高(70

75℃)。所以，其主要用途是PCR及DNA測序(含有二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA)。保真PCR酶有TmaDNA聚合酶(Thermotoamaritima

海棲熱袍菌)、TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis

海棲熱球菌)、PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus

激烈火球菌)、PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesi

沃氏火球菌)?；蚬こ淘砼c技術(shù)第59頁六、逆轉(zhuǎn)錄酶①5’→3’聚合酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA或DNA為模板合成DNA分子，不過后者合成很慢；

基因工程原理與技術(shù)第60頁②RNA酶H活性。能從5’或3’方向特異地降解DNA/RNA雜交分子中RNA鏈。

基因工程原理與技術(shù)第61頁

商品化逆轉(zhuǎn)錄酶主要是鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和Moloney鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus，Mo-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶。

其用途有：

①合成cDNA第一鏈，構(gòu)建cDNA文庫；②RT-PCR；③以RNA為模板制備DNA探針；④補(bǔ)平和標(biāo)識(shí)5’-末端突出DNA片段；⑤代替Klenow酶用于DNA序列分析?；蚬こ淘砼c技術(shù)第62頁第四節(jié)修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(末端轉(zhuǎn)移酶)

末端轉(zhuǎn)移酶能在二價(jià)陽離子作用下，催化DNA聚合作用，但不需要模板，將脫氧核糖核苷酸加到DNA分子3’-OH末端。AAAAAAMg2+dATP末端轉(zhuǎn)移酶效率高Co2+dATP末端轉(zhuǎn)移酶AAAAAAAAAAAAAAAAAAA效率低基因工程原理與技術(shù)第63頁用途：①給載體和外源DNA(如cDNA或隨機(jī)切割DNA)接上同聚物尾，方便連接；②末端標(biāo)識(shí)基因工程原理與技術(shù)第64頁二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脫氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA(一)核糖核酸酶1、核糖核酸酶A(RNaseA)RNaseA是一個(gè)內(nèi)切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上嘧啶殘基3’端磷酸酯鍵。其反應(yīng)條件極寬，且極難失活。在低鹽濃度(0~100mmol/LNaCl)下，RNaseA切割單鏈和雙鏈RNA、DNA/RNA中RNA；當(dāng)NaCl濃度為300mmol/L或更高時(shí)，RNaseA就特異性切割單鏈RNA。

基因工程原理與技術(shù)第65頁RNaseA用途:①確定RNA或DNA中單堿基突變位置；②經(jīng)過RNA雜交技術(shù)檢測特定RNA(特異降解單鏈RNA，對(duì)雜交雙鏈RNA不起作用)，較northern雜交靈敏；③轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及內(nèi)含子剪接位點(diǎn)分析，其靈敏度比S1核酸酶分析法高數(shù)倍；

④降解DNA樣品中RNA分子。2、核糖核酸酶T1

RNaseT1也是一個(gè)內(nèi)切核糖核酸酶，可特異攻擊RNA上鳥嘌呤殘基3’端磷酸酯鍵。其催化活性與用途類似于RNaseA。基因工程原理與技術(shù)第66頁3、核糖核酸酶HRNaseH特異地降解DNA/RNA雜交雙鏈中RNA鏈，產(chǎn)生含有3’-OH和5’-磷酸末端寡核苷酸和單核苷酸，不能降解單鏈或雙鏈DNA或RNA。

其用途是產(chǎn)生cDNA第二鏈合成引物。RNaseHPolIdNTPPolIdNTPDNA連接酶基因工程原理與技術(shù)第67頁(二)

脫氧核糖核酸酶I

DNaseI是一個(gè)內(nèi)切脫氧核糖核酸酶，可從嘧啶核苷酸5’-端磷酸隨機(jī)降解單鏈或雙鏈DNA，生成含有5’-磷酸末端寡核苷酸。Mg2+Mn2+用途：①產(chǎn)生大腸桿菌DNA聚合酶I切口平移切口；②在Mn2+存在下，產(chǎn)生構(gòu)建基因組文庫大片段DNA；③DNasel足跡法測定DNA結(jié)合蛋白在DNA上準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)；④除去RNA樣品中DNA?；蚬こ淘砼c技術(shù)第68頁(三)S1核酸酶作用特點(diǎn)：①需要Zn2+和酸性條件(pH4.0~4.5)；②降解單鏈DNA或RNA，但降解DNA速度大于降解RNA速度(7倍)；③降解方式為內(nèi)切和外切，內(nèi)切為主；④酶量過大時(shí)也可降解雙鏈核酸，為單鏈1/75000。用途：①切掉DNA片段單鏈突出末端產(chǎn)生平頭末端；②在雙鏈cDNA合成時(shí)切除發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)；③S1核酸酶作圖分析。

如內(nèi)含子數(shù)目、大小、位置分析及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與終止位點(diǎn)分析等。

基因工程原理與技術(shù)第69頁內(nèi)含子數(shù)量及大小分析DNAmRNA分子雜交RERES1核酸酶變性凝膠電泳MABM：分子量MarkerA：未經(jīng)S1酶處理B：經(jīng)S1酶處理但不能定位內(nèi)含子基因工程原理與技術(shù)第70頁轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)定位分析RERERE酶切堿性磷酸酯酶多核苷酸激酶**變性后與mRNA雜交*S1核酸酶*變性凝膠電泳MAB基因工程原理與技術(shù)第71頁三、核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是一類從多核苷酸鏈末端開始逐一降解核苷酸酶。

單鏈核酸