實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)專家講座

試驗(yàn)1大腸桿菌培養(yǎng)和分離實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第1頁(yè)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：1.進(jìn)行大腸桿菌擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)操作。2.進(jìn)行大腸桿菌分離，用固體平面培養(yǎng)基本進(jìn)行細(xì)菌劃線培養(yǎng)。3.說(shuō)明大腸桿菌培養(yǎng)條件和試驗(yàn)原理。實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第2頁(yè)一、基礎(chǔ)知識(shí)(一)微生物:1.特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)普通不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.2.微生物包含五類病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第3頁(yè)(二)培養(yǎng)基1.分類(按物理形態(tài)分)(1)液體培養(yǎng)基(2)固體培養(yǎng)基慣用固體培養(yǎng)基:

瓊脂固體培養(yǎng)基.②微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng),能夠形成肉眼可見(jiàn)菌落.實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第4頁(yè)2.培養(yǎng)基內(nèi)所含基本物質(zhì)(1)水(2)碳源(3)氮源(4)無(wú)機(jī)鹽實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第5頁(yè)3.培養(yǎng)基內(nèi)所需其它條件(1)pH值如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性(2)特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)----?如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素(3)氧氣含量如:培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)需要提供無(wú)氧條件生長(zhǎng)因子實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第6頁(yè)(三)無(wú)菌技術(shù)1、取得純凈培養(yǎng)物關(guān)鍵:2、無(wú)菌技術(shù)四個(gè)方面(參看教材20頁(yè))3、消毒與滅菌(1)消毒：概念：使用較為溫和物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害微生物。包含芽孢和孢子嗎？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶消毒化學(xué)藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外線消毒(不包含芽孢和孢子)預(yù)防外來(lái)雜菌入侵實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第7頁(yè)（2）滅菌概念：使用強(qiáng)烈理化原因殺死物體內(nèi)外全部微生物，包含芽孢和孢子。方法：a

灼燒滅菌b

干熱滅菌c

高壓蒸汽滅菌灼燒滅菌微生物接種工具(接種環(huán)、接種針)或其它金屬用具直接在火焰充分燃燒層灼燒注意適用范圍實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第8頁(yè)干熱滅菌

160－170℃；1－2h能耐高溫需要保持干燥物品(玻璃器皿)高壓蒸汽滅菌100kPa121℃15-30min通慣用于培養(yǎng)基滅菌實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第9頁(yè)二、試驗(yàn)操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計(jì)算－稱量－溶化－滅菌－倒平板（二）分離純化大腸桿菌接種方法有：劃線分離法和涂布分離法（三）將接種后培養(yǎng)基和一個(gè)未接種培養(yǎng)基放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)12h和24h后，觀察并統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第10頁(yè)三、課題延伸：菌種保藏1、斜面保藏（暫時(shí)保留）2、甘油保藏（長(zhǎng)久保留）實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第11頁(yè)試驗(yàn)1：大腸桿菌培養(yǎng)和分離設(shè)備及用具：滅菌鍋或高壓鍋、250ml三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm培養(yǎng)皿、接種環(huán)和玻璃三角刮刀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、酒精燈和超凈臺(tái)、一次性塑料手套、裝有酒精棉球廣口瓶、鑷子、有棉塞試管（15mm×120mm）5支試驗(yàn)材料：(1)50mlLB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml。(2)大腸桿菌菌種斜面(3)空白斜面

實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第12頁(yè)試驗(yàn)步驟(1)滅菌：將配制好50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB液體培養(yǎng)基分別裝入兩個(gè)250ml三角瓶中，加上封口膜，用高壓鍋進(jìn)行滅菌。(2)制平板：在酒精燈火焰旁將固體培養(yǎng)基分別倒在4個(gè)培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基鋪平皿底部，待凝，使之形成平面。(3)接種擴(kuò)大培養(yǎng)：靠近酒精燈火焰將大腸桿菌接種到三角燒瓶液體培養(yǎng)基中，三角燒瓶在37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。(4)劃線分離：將搖床上培養(yǎng)12h菌液在固體培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線，然后將蓋好培養(yǎng)皿倒置，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(5)單菌落接種培養(yǎng)：在無(wú)菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37℃下培養(yǎng)24h,4℃冰箱保留。實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第13頁(yè)單菌落實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第14頁(yè)試驗(yàn)討論

試驗(yàn)完成后，接觸過(guò)細(xì)菌器皿應(yīng)怎樣處理？試驗(yàn)完成后，全部接觸過(guò)細(xì)菌器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，尤其是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，所以必須高壓滅菌。使用后廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對(duì)于取樣器取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30min,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第15頁(yè)無(wú)菌技術(shù)四個(gè)方面（1）對(duì)試驗(yàn)操作空間、操作者衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；（3）為防止周圍微生物污染，試驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行；（4）防止已滅菌處理材料用具與周圍物品相接觸。(三)無(wú)菌技術(shù)返回實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第16頁(yè)倒平板實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第17頁(yè)討論:(1).培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么方法來(lái)預(yù)計(jì)培養(yǎng)基溫度？(2).為何需要使錐形瓶瓶口經(jīng)過(guò)火焰？(3).平板冷凝后，為何要將平板倒置？(4).在倒平板過(guò)程中，假如不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為何？提醒：能夠用手觸摸盛有培養(yǎng)基錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶溫度下降到剛才不燙手時(shí)，就能夠進(jìn)行倒平板了。答：經(jīng)過(guò)灼燒滅菌，預(yù)防瓶口微生物污染培養(yǎng)基。答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后培養(yǎng)基表面濕度也比較高，將平板倒置，既能夠使培養(yǎng)基表面水分更加好地?fù)]發(fā)，又能夠預(yù)防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中微生物可能在皿蓋與皿底之間培養(yǎng)基上滋生，所以最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。返回實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第18頁(yè)1、平板劃線法實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第19頁(yè)討論:(1).為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，依然需要灼燒接種環(huán)嗎？為何？(2).在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？(3).在作第二次以及其后劃線操作時(shí)，為何總是從上一次劃線末端開(kāi)始劃線？答：操作第一步灼燒接種環(huán)是為了防止接種環(huán)上可能存在微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上菌種直接起源于上次劃線末端，從而經(jīng)過(guò)劃線次數(shù)增加，使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐步降低，方便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留菌種，防止細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：劃線后，線條末端細(xì)菌數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開(kāi)始，能使細(xì)菌數(shù)目伴隨劃線次數(shù)增加而逐步降低，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)菌落。返回實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第20頁(yè)2.稀釋涂布法:(1)系列稀釋操作:實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第21頁(yè)涂布平板操作討論:涂布平板全部操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)怎樣進(jìn)行無(wú)菌操作？提醒：應(yīng)從操作各個(gè)細(xì)節(jié)確保“無(wú)菌”。比如，酒精燈與培養(yǎng)皿距離要適當(dāng)、吸管頭不要接觸任何其它物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。返回實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第22頁(yè)返回菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)，含有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)子細(xì)胞群體，叫做菌落。不一樣細(xì)菌菌落特征不一樣菌落是判定菌種主要依據(jù)。實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌的分離和培養(yǎng)第23頁(yè)(2)碳源可作為碳源物質(zhì)有:含碳無(wú)機(jī)物:、、含碳有機(jī)物：蛋白質(zhì)脂肪酸返回不一樣微生物所利用碳源不一樣異養(yǎng)型微生物碳源為自養(yǎng)型微生物碳源為