第7章細菌的遺傳分析

第7章

細菌的遺傳分析了解細菌在遺傳學研究中的意義及其研究方法掌握細菌重組的特點以及如何利用中斷雜交、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導進行基因定位和作圖

1第一節(jié)

細菌的細胞和染色體一、細菌細胞細菌細胞比較小，平均每個細胞含有1－2條染色體，沒有核膜，具有擬核2細菌染色體大多是雙鏈環(huán)狀的DNA分子，無蛋白質(zhì)與之結(jié)合；通常含有一個或多個環(huán)狀質(zhì)粒；比較容易接受其它DNA片段的插入二、細菌染色體及其遺傳特點3供體菌和受體菌DNA片段從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌中，這種轉(zhuǎn)移過程是單向的。4內(nèi)基因子(endogenote)和外基因子(exogenote)只有偶數(shù)次交換才能產(chǎn)生有活性的重組子相反的重組子(reciprocalrecombinant)不出現(xiàn)，所以在選擇培養(yǎng)基上只出現(xiàn)一種重組子細菌重組中，有兩個特點5AgeneticexchangeoccursbetweenthemainbacterialchromosomeandacircularDNA(plasmid)thatenteredtherecipientcell.6第二節(jié)

大腸桿菌的突變型及篩選一、大腸桿菌的突變類型1.合成代謝功能的突變型(anabolicfunctionmutants)合成代謝功能(anabolicfunctions)：野生型(wildtype)在基本培養(yǎng)基上具有合成所有代謝和生長所必需的有機物的功能。營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)：野生型品系的某個必需基因發(fā)生突變，導致不能完成一個特定的生化反應，從而阻礙整個合成代謝功能的實現(xiàn)。7野生型菌落同一菌落無性分裂原養(yǎng)型不同菌落突變營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型細菌表型的命名：突變型：Met－、Thi－、Pur－

野生型：Met＋、Thi＋、Pur＋

82.分解代謝功能的突變型(catabolicfunctionalmutation)分解代謝功能(catabolicfunction):指野生型E.coli能利用比葡萄糖復雜的不同碳源，轉(zhuǎn)化成葡萄糖或其他簡單的糖類，也能把復雜的氨基酸或脂肪分子降解成乙酸或三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物的功能突變型：Lac－、ara－、

lacZ－、lacY－野生型：Lac＋、ara＋

、

lacZ＋、lacY＋93.抗性突變型細菌由于某基因的突變而對某些噬菌體或抗菌素產(chǎn)生抗性(resistant)。突變型：Strr、T1r野生型：Strs、T1s10細菌中常用的若干突變型基因符號ara阿拉伯糖不能利用met甲硫氨酸缺陷型arg精氨酸缺陷型pur嘌呤缺陷型ade腺嘌呤缺陷型pyr嘧啶缺陷型bio生物素缺陷型str鏈霉素抗性cys半胱氨酸缺陷型thi硫胺缺陷型gal半乳糖不能利用thr蘇氨酸缺陷型lac乳糖不能利用ton噬菌體T1抗性leu亮氨酸缺陷型trp色氨酸缺陷型11二、突變型的篩選1.糖發(fā)酵性突變株Lac－的篩選Lac＋

＋

Lac－依紅-美藍(EMB培養(yǎng)基)金屬光澤紫色菌落(Lac＋)白色菌落(Lac－)＋2.營養(yǎng)缺陷型突變的篩選營養(yǎng)缺陷型突變(X射線、紫外線等)完全培養(yǎng)基不能生長的菌落鑒定突變型基本培養(yǎng)基印跡法基本培養(yǎng)基＋aa所有菌落12第三節(jié)

大腸桿菌的性別1.Thediscoveryofconjugation(接合生殖)In1946,J.Lederberg&E.L.TatumdiscoveredthatE.colicellscanexchangegeneticmaterialthroughtheprocessofconjugationandpublishedinNature.13菌株A和菌株B雜交，產(chǎn)生野生型met+bio+thr+leu+(出現(xiàn)頻率為10-7)這種能夠在基本培養(yǎng)基上生長的細菌是由于營養(yǎng)上的互補呢(即一些物質(zhì)從一個菌株的細胞中泄漏出來而為另一菌株的細胞所吸收)？還是遺傳物質(zhì)重組產(chǎn)生的？菌株A：met-bio-thr+leu+菌株B：met+bio+thr-leu-DavisU-tube說明野生型是遺傳物質(zhì)交換產(chǎn)生的152.F因子與高頻重組(1)F因子一種環(huán)狀DNA分子，～6×104bp，大約占E.coli染色體全長的2％，可編碼94個蛋白質(zhì)分子，與細菌的結(jié)合作用有關；供體細胞含有F因子，稱為F＋菌株，受體細胞不含F(xiàn)因子，稱為F－菌株；16F因子結(jié)構圖:F因子包含3個區(qū)域：轉(zhuǎn)移起點；致育基因，編碼形成F纖毛的蛋白質(zhì)；配對區(qū)，使F因子可以與細菌染色體中多處序列配對，通過交換整合到染色體中。17F+菌株與F-菌株的接合18F因子的特點:F因子具有形成性傘毛的基因，使得F＋與F－結(jié)合；F＋與F＋、F－與F－間不結(jié)合F＋×F－雜交19F＋因子的繁殖:細菌分裂使得F＋細菌產(chǎn)生F＋細菌，F(xiàn)－細菌產(chǎn)生F－細菌；F＋細菌丟失F因子，成為F－細菌(acriflavine處理)；F＋細菌與F－細菌混合培養(yǎng)時，F(xiàn)－細菌可以轉(zhuǎn)變?yōu)镕＋細菌；F＋與F－雜交，只有F因子的傳遞，細菌的染色體并不轉(zhuǎn)移，二者的重組頻率只有10-6，因此F＋品系稱為低頻重組系（Lfr）。20

(2)高頻重組(Hfr)In1950,Cavalli-StbrzatreatedanF+strainofE.coliK12withnitrogenmustard,apotentchemicalknowntoinducemutations.Fromthesetreatedcells,herecoveredastrainofdonorbacteriathatunderwentrecombinationatarateof10-4.In1953,W.Hayesisolatedanotherstraindemonstratingasimilarelevatedfrequency.BothstrainsweredesignatedHfr,orhigh-frequencyrecombination.BecauseHfr-cellsbehaveaschromosomedonors,theyareaspecialclassofF+cells.21F＋×F－F＋Hfr×F－F＋所有很少Why?22F因子整合到細菌染色體Hfr與受體細菌染色體的等位基因間可以重組(10-2)23F－細胞得到的只是部分F因子，其余部分依賴于整條Hfr染色體的轉(zhuǎn)移。這樣在Hfr×F-雜交后代大多數(shù)重組子仍為F－Hfr細胞和F-細胞之間的接合，一般很少有整條Hfr染色體轉(zhuǎn)入F－細胞(pilus容易斷裂)，因此：F－受體細胞只接受部分的供體染色體，這樣的細胞稱為部分二倍體(partialdiploid)或半合子(merozygote)Hfr×F－F＋很少？24第四節(jié)

中斷雜交與重組作圖WollmanandJacob(1954)設計試驗，證明基因從Hfr細胞按次序轉(zhuǎn)入F－細胞，可以根據(jù)基因進入F－細胞的時間和次序制作基因圖譜。一、中斷雜交實驗原理F.JacobE.Wollman25Hfrthr+leu+azirlac+gal+strsF-

thr-leu-azislac-gal-strr×間隔一定時間取樣，攪拌以中斷雜交，稀釋菌液，防止再度配對基本培養(yǎng)基＋鏈霉素重組子thr+leu+strr中斷雜交實驗26中斷雜交實驗結(jié)果基因轉(zhuǎn)入時間(min)頻率thr+(蘇氨酸)8100leu+(亮氨酸)8.5100azs(疊氮化鈉)990Tis(T1s)1170lac+(乳糖利用)1840gal+(半乳糖利用)2525二、中斷雜交作圖27(T1S)28OazitonlacgalF致育因子(F+)最后轉(zhuǎn)移到受體，是線性染色體的最后一個單位。09111825Oazitonlacgal根據(jù)中斷雜交技術作出的E.coli連鎖圖基因圖距單位是分鐘29不同Hfr菌株進行中斷雜交試驗，都可以作成連鎖圖，可是基因轉(zhuǎn)移的順序、轉(zhuǎn)移起點和轉(zhuǎn)移方向卻很不相同。Why?大腸桿菌的染色體呈環(huán)形表

幾個Hfr菌株的基因順序

菌株

轉(zhuǎn)

移

順

序

HfrH

O

thr

azi

lac

tsx

gal

trp

mal

xyl

metB

thi

F

C

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F

P72

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30幾個Hfr菌株的基因順序

菌株

轉(zhuǎn)

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xyl

F

3132重組作圖(recombinationmapping)是根據(jù)基因間重組率進行基因定位三、重組作圖33Hfrlac+ade+strs×lac－ade－strrF－例如：有兩個基因，lac和ade，根據(jù)中斷雜交試驗，知道這兩基因是緊密連鎖的，而且ade是在lac之后進入F－受體的。相互作用60分鐘基本培養(yǎng)基(鏈霉素)重組子lac+ade+strr34Hfrlac+ade+轉(zhuǎn)入受體細胞后的表現(xiàn)A.因為供體Hfr轉(zhuǎn)入片斷不能獨立復制，如果未進入F－受體的基因組中去，那么在以后的細胞分裂中就丟失了B.如已進入F－基因組，而且在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基上表型為F－lac＋ade＋，表明是這兩個基因之外發(fā)生雙交換的產(chǎn)物，在lac—ade兩基因之間并未發(fā)生重組35因此lac與ade之間的圖距應為：Lac-ade＝lac--ade+lac+-ade+lac--ade+×100＋＝lac--ade+ade+×100C.只有在缺乏腺嘌呤的完全培養(yǎng)基上選出lac－ade＋才是其真正的重組子36如果基因距離較遠用中斷作圖很有效；如基因距離較近，用中斷雜交不準確中斷雜交可為重組作圖提供某些基因之間的連鎖關系及其前后次序的依據(jù)重組作圖與中斷雜交作圖37重組特點：高等生物雙交換的頻率大大低于單交換微生物則四交換大大低于雙交換利用三點測驗定位緊密連鎖基因381、a+b+c-×a-b-c+(正交組合)2、a-b-c+×a+b+c-(反交組合)關鍵是確定哪個基因處于中間，a-b-c還是a-c-b？DonorRecipientacbacb39cross1:a+b+c-×a-b-c+cross2:a-b-c+×a+b+c-Iforderisa-b-c,thenthefrequencyofa+b+c+incross1=a+b+c+incross2;Iforderisa-c-b,thenthefrequencyofa+b+c+incross1<<a+b+c+incross242帶有細菌基因的環(huán)狀F因子稱為F＇因子(F'-factor)1.F＇因子F＇因子在細菌染色體上插入位置不同而構成不同的Hfr品系，由此可形成不同的F＇因子第五節(jié)F＇因子和性導不同的F＇因子攜帶細菌的不同基因如果F＇因子本身的基因丟失，轉(zhuǎn)移就可能停止F＇因子不存在蛋白質(zhì)外殼的包裝問題，可以攜帶不同長度的DNA片段F＇因子和F＋一樣能把F因子轉(zhuǎn)移給F－細胞，同時也能轉(zhuǎn)移細菌基因，其結(jié)果使F－變成F＇菌株，并形成部分二倍體F＇因子的特點：442.性導(sexduction)性導指利用F＇因子將供體細胞的基因?qū)胧荏w形成部分二倍體的過程Hfr×F－conjugationF′×F－sexductionthr+leu+strsthr-leu-strr×45AHfr:thr+leu+strs×F－:thr-leu-strrB:F':thr+leu+strs×F－:thr-leu-strr基本培養(yǎng)基(strr)篩選出F－：thr+leu+strr篩選出F'：thr+leu+strrF－無活性F’有活性F-F-46性導在大腸菌株的遺傳學分析中的作用1.由性導形成的部分二倍體如果不發(fā)生重組，則：F＇因子能自主復制，可在細菌細胞中延續(xù)下去性導所形成的部分二倍體可用作不同突變型之間的互補測驗，以確定兩個突變型是同一基因或是兩個不同基因觀察由性導形成的雜合部分二倍體中某一性狀的表現(xiàn)，可以確定這一性狀其等位基因的顯隱性關系不同的F＇因子帶有不同的細菌DNA片段，因此利用不同的F＇因子可以測定不同基因在一起性導的頻率，并以此來作圖472.如果部分二倍體中出現(xiàn)重組，則：F＇因子同受體細菌染色體之間發(fā)生單交換，形成Hfr品系，同時F＇因子上所攜帶的基因發(fā)生重組如果發(fā)生雙交換，F(xiàn)＇因子的細菌基因和受體染色體上的等位基因之間發(fā)生交換,則形成新的F＇品系48三種不同的致育因子的相互關系F+HfrF′F-4950第六節(jié)

轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導作圖一、細菌的轉(zhuǎn)化與作圖受體部位(receptorsite)：外源DNA片段進入受體細菌形成臨時性通道的特定區(qū)域感受態(tài)細胞(competencecell)：能接受外源DNA分子并被轉(zhuǎn)化的細菌細胞感受態(tài)因子(competencefactor)：促進轉(zhuǎn)化作用的酶或蛋白質(zhì)分子外源DNA的轉(zhuǎn)化過程：雙鏈DNA分子與受體部位進行可逆性結(jié)合；DNA分子進入細胞，并要防止受體DNA酶的消化；雙鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA，其中一條鏈被降解；另一條鏈與染色體同源區(qū)域形成雜合DNA分子；雜合DNA經(jīng)復制、分離后形成子代的轉(zhuǎn)化子。5152利用轉(zhuǎn)化作圖觀察兩個基因同時轉(zhuǎn)化的頻率，判斷兩者是否連鎖；確定連鎖關系后，通過轉(zhuǎn)化后外源片段與受體基因發(fā)生重組來確定遺傳距離。同時轉(zhuǎn)化的兩個基因不一定都是連鎖的，如何判斷兩個基因是位于同一片段還是位于不同的片段同時轉(zhuǎn)化一個宿主細胞？ABBAABAB稀釋10倍后再轉(zhuǎn)化ABABABABABAB轉(zhuǎn)化AB共轉(zhuǎn)化頻率AB共轉(zhuǎn)化頻率也下降10倍BABABBAAAB轉(zhuǎn)化AB共轉(zhuǎn)化頻率稀釋10倍后再轉(zhuǎn)化AB共轉(zhuǎn)化頻率下降100倍Naster等用枯草桿菌的一個菌株trp2+his2+tyr1+作為供體，提取DNA向受體trp2-his2-tyr2-轉(zhuǎn)化,計算基因之間的重組值2390/17990=0.13418+1180+685+107=239011940+3660=15600his2-tyr18125/20172=0.402600+1180+3660+685=812511940+107=12047trp2-tyr16785/19905=0.342600+107+3660+418=678511940+1180=13120trp2-his2重組體數(shù)/總數(shù)(+-)或(-+)(++)重組值重組型親本型11801072600418685366011940總數(shù)－＋－－＋＋＋tyr1＋－－＋－＋＋his2＋＋＋－－－＋trp2轉(zhuǎn)化體類別座

位(供體)trp2+his2+tyr1+×trp2-his2-tyr1-(受體)3個基因的次序為：trp2his2tyr1trp2his2tyr1341356二、轉(zhuǎn)導與作圖轉(zhuǎn)導(transduction)是指以噬菌體為媒介，將細菌的小片段染色體或基因從一個細菌轉(zhuǎn)移到另一細菌的過程NortonZinderandLederberg(1952)wereinvestigatingpossiblerecombinationinthebacteriumsalmonellatyphimurium(鼠傷寒沙門氏菌)LA22:phe－trp－tyr+his+LA2:phe+trp+tyr－h(huán)is－57LA22:phe－trp－tyr+his+LA2:phe+trp+tyr－h(huán)is－基本培養(yǎng)基無無＋野生型10－5TheseobservationsatfirstsuggestedthatrecombinationinvolvedwasthetypeobservedearlierinconjugativestrainsofEcoli.5859進一步實驗過濾因子屬大腸桿菌的P22(沙門氏桿菌噬菌體)過濾因子的大小和質(zhì)量與P22相同過濾因子用抗P22血清處理后失活用抗性品系代替LA2敏感品系，在U型管兩端均無野生型重組體LA22是帶有P22原噬菌體的溶源性細菌，LA2是對P22敏感的非溶源性細菌60LysogenicLA22withP22FewLA22convertsintolyticcycleCuttingLA2DNAintofragmentsSynthesisofP22’sproteinP22releasedfromLA22andinfectsLA261OnefragmentofLA2waspackagedintoP22DefectiveP22turnsbacktoinfectLA22DNAfromLA2(trp+)wasintegratedintoLA22’schromosome6263641.普遍性轉(zhuǎn)導與作圖噬菌體所攜帶的供體(細菌)染色體片段是完全隨機的，即供體基因組中所有基因具有同等機會被轉(zhuǎn)導形成部分二倍體，經(jīng)交換和重組后，形成轉(zhuǎn)導頻率大致相等的不同轉(zhuǎn)導子，這種轉(zhuǎn)導稱為普遍性轉(zhuǎn)導(generaltransduction)轉(zhuǎn)導局限性轉(zhuǎn)導普遍性轉(zhuǎn)導65共轉(zhuǎn)導或并發(fā)轉(zhuǎn)導(cotransduction)：指兩個基因同時轉(zhuǎn)導的現(xiàn)象雙因子轉(zhuǎn)導(two-factortransduction)實驗：就是每次觀察兩個基因的轉(zhuǎn)導，通過每兩個基因的共轉(zhuǎn)導頻率確定這些基因在染色體上的順序如果兩個基因共轉(zhuǎn)導的頻率愈高，表明兩個基因連鎖愈緊密，相反共轉(zhuǎn)導頻率愈低，則表明兩個基因距離愈遠66例如，用大腸桿菌的P1噬菌體進行下列轉(zhuǎn)導實驗，測定thr+1eu+aziS的連鎖關系三因子轉(zhuǎn)導：只做一次實驗就可以推出3個基因的次序67P1噬菌體Ecoli(thr+1eu+azir)Ecoli(thr-1eu-azis)thrleuazileuazithr基本培養(yǎng)基不含leu100%leu+,50%azir,2%thr+不含thr100%thr+,3%leu+,0%azir哪個圖正確？68以大腸桿菌trpA+supC+pyrF+細胞作為供體，trpA-supC-pyrF-作受體，由P1噬菌體作為載體進行轉(zhuǎn)導。首先選擇supC+,然后檢測supC+轉(zhuǎn)導過程中其他兩個基因被轉(zhuǎn)導的情況，結(jié)果如下：supC+

trpA+pyrF+36supC+

trpA+pyrF-114supC+

trpA-pyrF+0supC+

trpA-pyrF-4536033個基因的次序為supC

trpA

pyrF最難轉(zhuǎn)導，中間發(fā)生交換的結(jié)果69共轉(zhuǎn)導頻率：supC+trpA+＝(36