實驗紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量

關于實驗紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量一、實驗目的：學習紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理；熟練掌握紫外分光光度計測定原理及使用方法。第2頁,共16頁，2024年2月25日，星期天二、實驗原理：由于蛋白質(zhì)中存在著酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸殘基，它們的結(jié)構(gòu)中具有共軛雙鍵，對紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內(nèi)吸收峰的光密度值OD280nm與其濃度（范圍是0.1~1.0mg/ml）成正比關系，280nm的吸光度故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。第3頁,共16頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共16頁，2024年2月25日，星期天本法操作簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，低濃度的鹽類不干擾測定，在蛋白質(zhì)和酶的生化制備及其它研究中應用廣泛，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量測定，尤其是適合于柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測。核酸在280nm波長下也有一定吸收能力，可能發(fā)生干擾。混有核酸時必須分別測定280nm和260nm兩處的OD值，然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值，通過經(jīng)驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實含量，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。第5頁,共16頁，2024年2月25日，星期天三、實驗材料、主要儀器和試劑1．試驗材料：待測的蛋白質(zhì)溶液。2．主要儀器：（1）紫外分光光度計（2）試管與試管架（3）移液管3．試劑：濃度為1mg/mL標準酪蛋白溶液第6頁,共16頁，2024年2月25日，星期天四、操作步驟1．標準曲線制作按表1分別向每支試管內(nèi)加入各種試劑，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長處測定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標準曲線。第7頁,共16頁，2024年2月25日，星期天2．樣品測定：

取待測蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水9mL，混勻，按上述方法測定280nm的光密度，并從標準工作曲線上查出待測蛋白質(zhì)溶液的濃度。第8頁,共16頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共16頁，2024年2月25日，星期天分光光度計的使用第10頁,共16頁，2024年2月25日，星期天分光光度計的分類分光光度計的分類紅外分光光度計:可見光分光光度計:紫外分光光度計:測定波長范圍為大于760nm的紅外光區(qū)

測定波長范圍為400~760nm的可見光區(qū)測定波長范圍為200～400nm的紫外光區(qū)第11頁,共16頁，2024年2月25日，星期天分光光度計的基本結(jié)構(gòu)

無論哪一類分光光度計都包括：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光度計各部件的次序如圖所示:

5個基本部件第12頁,共16頁，2024年2月25日，星期天紫外分光光度計

1．光源：鎢燈或鹵鎢燈——可見光源400～760nm

氫燈或氘燈——紫外光源200～400nm2．單色器：把混合光波分解為單—波長光的裝置

3．吸收池（比色皿）：

玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)

石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)4．檢測器：將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置

5．記錄裝置：訊號處理和顯示系統(tǒng)第13頁,共16頁，2024年2月25日，星期天紫外可見分光光度計使用方法（1）（1）測試準備

①儀器預熱30min后方可進行測試。

②將盛有“空白”或“對照”溶液的比色皿處于試樣室光路位置；③選擇波長

④確定光源

（2）測試過程

①數(shù)字顯示透光度“100.0”(或吸光度“0.00”)2～3s后，將盛有標準溶液的比色皿移至光路②將盛有樣品溶液的比色皿移至光路，記錄該樣品的數(shù)據(jù)。待第一個樣品數(shù)據(jù)記錄完畢后，將第二個樣品置于試樣室光路………，若有多個樣品，操作以此類推。第14頁,共16頁，2024年2月25日，星期天分光光度計使用注意事項

（1）預熱是保證實驗結(jié)果準確可靠的必要步驟，不可忽略。（2）在波長320nm以下的實驗范圍一定要選用石英比色皿，絕不可以玻璃比色皿替代。（3）比色皿的清潔程度，直接影響實驗結(jié)果。因此，特別要將比色皿清洗干凈。先用自來水將用過的比色皿反復沖洗，然后用蒸餾水淋洗，倒立于濾紙片上，待干后再收回比色皿盒中。必要時，還要對比色皿進行更精細的處理，如用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡、沖洗。

（4）比