蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌檢疫鑒定方法

蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌檢疫鑒定方法本標準規(guī)定了植物檢疫中蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌的檢疫整定方法。本標準適用于來自蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌發(fā)生國家或地區(qū)相關寄主新鮮果實中的蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌的檢疫鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T2077進出境蘋果檢疫規(guī)程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。無論是無性繁殖或有性繁殖，結構簡單的或復雜的真菌產(chǎn)孢機構，統(tǒng)稱為子實體。分生孢子器sporudochidium半知菌球殼孢目真菌形成的一種子實體，球形或瓶形，產(chǎn)生分生孢子。半知菌的分生孢子著生在散生，束生的分生孢子?；蚍稚葑幼?，或著生在分生孢子盤或分生孢子器內(nèi)。分生孢子的形態(tài)變化很大，大致可分為7種類型。4方法原理4.1分類地位學名：SphaerupsispyriputrescensXiao蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌屬真菌界(Fungi),半知菌亞門(Deuteromyeotina),腔菌綱(Coelo4.2檢疲鑒定依據(jù)以病菌在寄主上的癥狀特點，病菌形態(tài)學特征及其培養(yǎng)特性、病菌種的特征以及基因組序列作為蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌的檢疫鑒定依據(jù)，必要時輔助進行致病性測定(見附錄A.附錄B.附錄C、5設備及用具5.1儀器設備體視顯微鏡、生物顯微鏡、電子天平(感量0.01g)、高壓滅菌器、超凈工作臺、生物培養(yǎng)箱(帶熒光燈)、高速離心機、PCR僅、實時熒光PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)。5.2實驗用具杯(500mL)、量筒(500ml.)、三角瓶(250mL)、載玻片、蓋玻片、微量移液器(可調(diào)式范圍：2.5gL~1000pL)、移液器槍頭(10pL、100pl.,1000pL)。6試劑和培養(yǎng)基1%NaClO溶液，無水乙醇，70%乙醇，無菌雙蒸水，2%CTABDNA提取緩沖液、10%SDS溶液、3mol/L.醋酸的溶液、PCR試劑《包括Tag聚合酶、dNTP、緩沖液》、實時熒光PCR混合液、苯酚、三氯甲烷、異戊醇、Tris-HCl、EDTA、ITS引物，實時熒光PCR引物和探針、瓊脂糖，DNA相對分子質量標準(DL2000Marker),0.5×TBE電泳緩沖液。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(見附錄A)。7標準菌株SphaeropsispyripntrescensXiao&.J.D.Reg口岸查驗進境水果時，按SN/T2077對來自疫區(qū)的蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌寄主的新鮮果實進行抽樣與取樣。9檢驗方法9.1現(xiàn)場檢驗將有明顯病癥病果置于體視顯微鏡下檢查，或直接挑取病部病原體制成玻片，置于生物顯微鏡下檢查，觀察記錄有無病菌的分生孢子座、分生孢子器以及分生孢子的形態(tài)特征和著生方式，并測量其大小。9.2實驗室檢驗9.2.1顯微鏡檢將有明顯病癥病果置于體視顯微鏡下檢查，或直接挑取病部病原體制成玻片，置于生物顯微鏡下檢查，觀察記錄有無病菌的分生孢子座，分生孢子器以及分生孢子的形態(tài)特征和著生方式，并測量其大小。9.2.2保濕培養(yǎng)如病果上只有可疑病狀面無明顯病癥，則將病果置于樣品袋中，于20℃~25℃下保濕培養(yǎng).定期觀察癥狀的變化，并進行顯微鏡檢或分離培養(yǎng)。9.2.3分離培養(yǎng)性狀和形態(tài)學觀察取可疑病果用70%的乙醇表面消毒，超凈工作臺上自然干燥，取病健交界的組織數(shù)塊(大小約5mm×5mm>.置于PDA平板上，于20℃~25℃黑暗下近紫外燈下培養(yǎng).待菌落出現(xiàn)后觀察菌落的形態(tài)、顏色，大小及子實體等培養(yǎng)性狀，顯微鏡檢分生孢子的形態(tài)特征。9.2.4病原菌致病性測定(必要時做)將Sphaeropxispyriputrescens在PDA培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)(12h光照/12h黑暗)3周，誘導產(chǎn)生分生泡子，用無菌水配制孢子懸浮液，濃度為1×101個孢子/ml。取采收前2周～4周沒有接觸過殺菌劑的富士蘋果進行致病性測定。果實用0.5%NaClO溶液表面消毒5min.無菌水漂洗3次，無菌條件下干燥后，用直徑為4mm的針頭，扎入果實內(nèi)形成深4mm的傷口，注入20μL孢子懸浮液進行接種，以接種無菌水作為對照。接種果實用網(wǎng)套包裹放于紙箱中，用纖維板隔開，0℃下保存，一般6周~8周可以觀察到接種Sphaeropsispyripatrescens的果實呈現(xiàn)腐爛癥狀。梨果實蒂部和萼端致病性測定，用無菌解剖刀在果實的蒂部平切造成1cm傷口，用無菌紗布(2cm×2cm)蘸下孢子懸浮液，覆蓋傷口接種，以范有無菌水的紗布包裹的傷口作為對照。接種水果放在鋁盤上，再將盤子置于有水的密閉容器中(20℃~22℃)過夜。然后去掉接種紗布，將果實放于紙箱上，用纖維板隔開，0℃下保存，一般2個~3個月后接種病菌果實呈現(xiàn)腐爛癥狀。每個菌株接種不少于5個。定期觀察接種果實的發(fā)病情況，發(fā)病后按照前述9.2.3方法分離病菌，對柯赫法則驗證的菌株進行形態(tài)學鑒定。9.2.5分子生物學鑒定CTAB法：參照《分子克隆實驗指南(第三版)》;或參照公司真菌DNA提取試劑盒，見附錄B。對提取的DNA,用設計的通用引物擴增ITS區(qū)域，PCR產(chǎn)物純化后調(diào)序，BLAST比對分析，見附錄C。9.2.5.3實時熒光PCR檢測對提取的DNA,用設計的特異性引物和探針進行實時熒光PCR檢測。實時熒光PCR反應體系和條件見附錄D,10.1癥狀特征果實蒂部和萼部腐爛是蘋果和梨果實球殼孢腐爛病主要癥狀。發(fā)病組織表面褐色，隨著病情的發(fā)展，病庭表面形成黑色的分生孢子器，分生孢子器分布于果皮的表面或者半埋生于組織內(nèi)。發(fā)病組織表皮褐色或深褐色，果肉褐色，隨時間延長病部顏色加深。切開病果散發(fā)類似“繃帶”一樣的氣味。10.2病菌培養(yǎng)特征分離物菌落在20℃黑暗下培養(yǎng)初期為液密，無色，7d~14d后，菌絲逐漸變?yōu)辄S色，菌落中有黃色素沉積是識別該菌的主要特征。轉入12h光照/12h黑暗的交替培養(yǎng)，3周后可于菌落上形成黑色的子座。10.3分生孢子形態(tài)特征分生孢子褐色，單孢，一端膨大，末端扁平，分生孢子大小(14μm～17μm)×(8ym~10gm)。10.4致病性結果(必要時采用致病性測定)接種果實應呈現(xiàn)典型的蘋果和梨果實球殼孢腐爛病的典型癥狀，經(jīng)病原菌再分離獲得的純菌株應具有與原菌株保持一致的病原特征，對照不出現(xiàn)蘋果和梨果實球殼孢腐爛病癥狀。10.5病菌ITS序列分析經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴增產(chǎn)物的片斷大小大約600bp。測序后進行BLAST比對，序列與GenBank中已知的蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌同源性為100%。10.6實時熒光PCR檢測進行實時熒光PCR檢測后，看有無Ct值。在常規(guī)的生物學方法檢測中.若發(fā)現(xiàn)癥狀，病原特征及致病性測定(必要時采用)與第10章描述特征相吻合，則判定檢出果實和梨球殼孢腐爛病菌。在分子生物學方法檢測中，如果待測樣品的序列與GenBank中已知的蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌同源性為100%或待測樣品的Ct值小于或等于35時，如果癥狀或者病原菌培養(yǎng)性狀與第10章鑒定特征吻合的，則判定檢出蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌。12樣品和資料的保存12.1菌種和DNA樣品的保藏蘋果和梨果實球殼孢腐爛病菌純分離物要標注菌株來源、寄主、分離時間、鑒定人；南株在含20%甘油的凍存管中于一80℃保存，或將菌株轉接在PDA斜面上培養(yǎng)，待菌絲體張滿斜面后，置于4℃下保存，并定期(180d)轉管。病菌基因組DNA樣品于-20℃下保存。保存期滿后，需經(jīng)滅菌處理12.2檢驗資料的保存妥善保存檢驗資料，以備復驗、談判和仲裁。檢驗報告應注明檢驗日期、方法、結果等，并有檢驗人2%CTAB,2%PVP,1,4mol/I.NaCl,100mmol/L.TrisHCl(pH8,0),25mmol/I.EDTA(規(guī)范性附錄)真菌DNA提取方法真菌DNA的提取采用CTAB方法，具體步驟如下：a)稱取0.2g菌絲，在液氮中研磨成粉末：b)轉入1mL.65℃預熱的抽提緩沖液(CTAB)中，顏例混勻，65℃溫育5min,中間混勻兩次：c)加入等體積三氯甲烷/苯酚(1/1)混勻，12000r/min離心15min,取上清液，等體積三氯甲烷/苯酚再抽提一次；d)上清液加入1/10體積3mol/L.醋酸鈉溶液輕輕混勻，再加入2倍體積冷凍無水乙醇于-20℃沉淀30mim,12000r/min離心10min;e)沉淀用70%乙醇洗兩遍，置于37℃溫箱干燥后，用TE溶解，1.0%瓊脂糖電泳檢測，-20℃保存。10×PCR緩沖液(含MgCl?)5dNTP(每2.5mmol/L.)422195*-CCCACCCTCTGTCTACAGTAa'-GAACCAAGAGATOCGTTGTTGA5-FAM-ACTCAGAOGACACTGATGATATGGGTTT-T111[1]XisoCL,RogersJD.2004.Apostharvestfruitrotind"Anjoupearscausecenssanov.PlantDis88:114-118.[2]RogersJD.BoalRI.2004.FirstreportofanewpostharvestfruitrSphaeropsispyriputrescens.PlantDis88;223.[3]SwartWJ,WingfieldMJ,PalmerMA,BlanchetteisolatesofSphaeropsissapinea.Phytopathology81:489-493.[4]MeheriukM.1993.CAstorageconditiensfortheSixthInternationalControlledAtmosphe