酶法測(cè)定鎂離子含量的方法及鎂離子診斷試劑盒的制作方法-2

酶法測(cè)定鎂離子含量的方法及鎂離子診斷試劑盒的制作方法專利名稱：酶法測(cè)定鎂離子含量的方法及鎂離子診斷試劑盒的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及酶法測(cè)定血漿、血清等樣品中鎂離子含量的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的鎂離子診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：目前醫(yī)學(xué)上測(cè)定血漿、血清等樣品中鎂離子含量(簡(jiǎn)稱鎂測(cè)定)的手段比較多，概括起來有比色法、熒光法、離子色譜法、離子選擇性電極法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀釋質(zhì)譜法(ID-MS)等。其中決定性的方法是ID-MS，其次是AAS，這兩種方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但設(shè)備復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，不適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室和自動(dòng)分析。比色法是應(yīng)用最廣泛的方法，包括甲基麝香草酚藍(lán)法(MTB)、達(dá)旦黃法、鄰甲酚酞絡(luò)合酮法(OCPC)、鈣鎂試劑法(Calmagite)以及新近報(bào)道的2-(8’-羥基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氮)-變色酸法(8Q5SAC)。比色法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，但存在試劑空白吸光度高、易受膽紅素和其它陽(yáng)離子干擾、試劑穩(wěn)定性差，以及試劑中含有腐蝕性或毒性成分等缺點(diǎn)。離子選擇性電極法(ISE)可以測(cè)定生理溶液中鎂離子活度，采用中性載體(ETH7025)液膜離子選擇電極，測(cè)定的準(zhǔn)確度較高，但仍存在生理范圍內(nèi)的鈣干擾，Ca2+最大干擾達(dá)10％。離子色譜法在測(cè)定之前需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，包括酸化稀釋和過濾。Thienpont等使用該方法對(duì)五種“國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)學(xué)會(huì)”用火焰原子吸收分光光度法的定值血清進(jìn)行了分析，結(jié)果平均偏差僅為0.35％，認(rèn)為離子色譜法可作為測(cè)定鎂元素總量的有價(jià)值的參考方法。酶法測(cè)定血漿、血清等樣品中鎂離子(主要是Mg2+)的研究近幾年非常活躍，取得了較大進(jìn)展。目前已應(yīng)用于Mg2+測(cè)定的酶學(xué)方法有①甘油激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法；④酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法；⑤磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法；⑥異檸檬酸脫氫酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)法?？傮w上看，采用酶法檢測(cè)鎂離子結(jié)果準(zhǔn)確、干擾小、適合于自動(dòng)化分析。但是，應(yīng)用不同的檢測(cè)試劑和測(cè)試路線，檢測(cè)的靈敏度、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)有很大差別，直接影響到該方法的使用與推廣，這正是人們?cè)谠擃I(lǐng)域內(nèi)不斷研究、發(fā)展和創(chuàng)新的原因所在。由于有著非常好的應(yīng)用前景，對(duì)酶法檢測(cè)鎂離子的研究已經(jīng)成為該領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種酶法測(cè)定鎂離子含量的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的鎂離子診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑，能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血漿、血清等樣品中鎂離子的含量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測(cè)定，以便推廣使用酶法檢測(cè)鎂離子的方法以及相應(yīng)的診斷試劑盒，使該領(lǐng)域內(nèi)檢測(cè)手段得到進(jìn)一步豐富和發(fā)展。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種酶法測(cè)定鎂離子含量的方法，采用以下步驟進(jìn)行首先，將血漿、血清等需要測(cè)定的樣品與含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，然后，將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm的吸光度的下降幅度，進(jìn)而測(cè)算出樣品中鎂離子的含量。測(cè)定過程中，被測(cè)樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500，反應(yīng)溫度控制在20℃～50℃，反應(yīng)時(shí)間控制在2～30分鐘，檢測(cè)時(shí)設(shè)定副波長(zhǎng)在405nm以上。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的鎂離子診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液40～200mmol/l，甘油1～40mmol/l，腺苷三磷酸0.2～20mmol/l，還原型輔酶0.2～0.3mmol/l，甘油激酶1000～50000U/l，甘油-3-磷酸脫氫酶1000～50000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積10～80％。也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，以利于消除內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，比如雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分甘油、腺苷三磷酸、還原型輔酶、甘油-3-磷酸脫氫酶等，可以放在試劑II；試劑II中的甘油激酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，還有利于試劑更穩(wěn)定與雙劑類似，三劑的配方也不僅僅限于上述配方，其中試劑I中的甘油、腺苷三磷酸、還原型輔酶等可以放在試劑II或試劑III中，試劑II中的甘油-3-磷酸脫氫酶可以放在試劑I或試劑III中，試劑III中的甘油激酶也可以放到試劑I或者試劑II中，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。上述診斷試劑盒的成分當(dāng)中，選擇緩沖液的基本要求是PH值在6.0～11.0范圍之內(nèi)，可以是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸(Tris-HCl)緩沖液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液”、“咪唑～鹽酸(Imidazole-HCl)緩沖液”、“雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸(Phosphate)緩沖液”或者“磷酸鹽(Phosphate-SodiumChloride，PBS)緩沖液”中的至少一種，但選擇范圍并不受這些列舉所限制。此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，其用量約占所在試劑總體積的10～80％(或者濃度在10～50mmol/l范圍之內(nèi))。用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。上述鎂離子診斷試劑盒的試劑成分當(dāng)中，所述氧化型輔酶是——氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述還原型輔酶是——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。研究表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的鎂離子診斷試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液80～120mmol/l，甘油10～20mmol/l，腺苷三磷酸2～8mmol/l，還原型輔酶0.2～0.3mmol/l，甘油激酶10000～30000U/l，甘油-3-磷酸脫氫酶10000～30000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積10～50％。本發(fā)明應(yīng)用鎂離子激活甘油激酶活性的特點(diǎn)，甘油激酶活性激化的程度與血漿、血清等被測(cè)樣品中鎂離子的含量成正比，在腺苷三磷酸的存在下與甘油反應(yīng)生成甘油-3-磷酸，再偶聯(lián)甘油-3-磷酸脫氫酶，將還原型輔酶反應(yīng)成氧化型輔酶。由于還原型輔酶在340nm有非常明顯的吸收峰，而它們對(duì)應(yīng)的氧化型輔酶在340nm沒有吸收峰，反應(yīng)所產(chǎn)生的吸光度的變化與樣品中鎂離子的含量成正比。因此，在固定時(shí)間間隔內(nèi)測(cè)定主波長(zhǎng)340nm處吸光度的下降幅度，便能很好地反映出樣品中鎂離子的含量。本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)，通過將還原型輔酶反應(yīng)成氧化型輔酶，定量反映出被測(cè)樣品中鎂離子的含量，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與酶偶聯(lián)反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測(cè)試過程精確度高；(3)該方法簡(jiǎn)便、易操作，可快速得到檢測(cè)結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會(huì)污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀上便可快速檢測(cè)，不需要特殊或額外儀器，測(cè)試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測(cè)定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑、干試劑等多種形式的試劑，主要用于測(cè)定人體和其它動(dòng)物體內(nèi)鎂離子的含量，也可以結(jié)合稀釋、濃縮等輔助手段來測(cè)定其它樣品中的鎂離子；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)鎂離子診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，存在于其中的各種酶的三維空間結(jié)構(gòu)保持完整，很好地保證了應(yīng)用測(cè)試效果。做成雙劑或者三劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測(cè)結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。實(shí)施例一(單劑)按以下成分和用量配制血清中鎂離子診斷試劑盒雙甘氨肽緩沖液80mmol/l，甘油10mmol/l，腺苷三磷酸2mmol/l，thio-NADH0.2mmol/l，甘油激酶10000U/l，甘油-3-磷酸脫氫酶10000U/l，乙二醇50％(占試劑總體積)。在全自動(dòng)生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間10分鐘、測(cè)試主波長(zhǎng)340nm、測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(吸光度下降，下同)。加入血清樣品和配成的單劑，兩者在分析儀內(nèi)部自動(dòng)混勻，檢測(cè)、記錄340nm吸光度的下降情況。一共檢測(cè)讀點(diǎn)31次，大約每隔20秒記錄一次數(shù)據(jù)，根據(jù)速率法、終點(diǎn)法等方法，對(duì)照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出血清樣品中鎂離子的含量。對(duì)同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測(cè)試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。實(shí)施例二(雙劑)按以下成分和用量配制血清中鎂離子診斷試劑盒試劑I——咪唑～鹽酸緩沖液100mmol/l，甘油15mmol/l，腺苷三磷酸5mmol/l，NADPH0.25mmol/l，甘油-3-磷酸脫氫酶20000U/l，乙二醇50％(占試劑I總體積)；試劑II——咪唑～鹽酸緩沖液100mmol/l，甘油激酶20000U/l，乙二醇50％(占試劑II總體積)。在全自動(dòng)生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度30℃、反應(yīng)時(shí)間15分鐘、測(cè)試主波長(zhǎng)340nm、測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。先加入血清樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動(dòng)混勻，檢測(cè)、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點(diǎn)法等方法，對(duì)照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出血清樣品中鎂離子的含量。對(duì)同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測(cè)試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。實(shí)施例三(三劑)按以下成分和用量配制血清中鎂離子診斷試劑盒試劑I——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，甘油20mmol/l，腺苷三磷酸8mmol/l，thio-NADPH0.3mmol/l，丙二醇20mmol/l；試劑II——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，甘油-3-磷酸脫氫酶30000U/l，丙二醇50％(占試劑II總體積)；試劑III——三乙醇胺緩沖液120mmol/l，甘油激酶30000U/l，乙二醇50％(占試劑III總體積)。在全自動(dòng)生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度25℃、反應(yīng)時(shí)間20分鐘、測(cè)試主波長(zhǎng)340nm、測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑I、試劑II和試劑III的總體積之比為1∶25，試劑I、試劑II和試劑III的用量為8∶1∶1，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。先加入血清樣品和試劑I、試劑II，5分鐘之后加入試劑III，它們?cè)诜治鰞x內(nèi)部自動(dòng)混勻，檢測(cè)、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點(diǎn)法等方法，對(duì)照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出血清樣品中鎂離子的含量。對(duì)同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測(cè)試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。實(shí)施例四(雙劑優(yōu)選例)按以下成分和用量配制血磷診斷試劑盒試劑I——Tris-HCl緩沖液100mmol/l，甘油10mmol/l，腺苷三磷酸3mmol/l，NADH0.25mmol/l，硫酸銨20mmol/l；試劑II——Tris-HCl緩沖液100mmol/l，甘油激酶16000U/l，甘油-3-磷酸脫氫酶16000U/l，硫酸銨20mmol/l。在全自動(dòng)生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間10分鐘、測(cè)試主波長(zhǎng)340nm、測(cè)試副波長(zhǎng)405nm以上，被測(cè)樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25，試劑I與試劑II的用量之比為4∶1，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。先加入血清樣品和試劑I，5分鐘之后加入試劑II，三者在分析儀內(nèi)部自動(dòng)混勻，發(fā)生以下原理性反應(yīng)檢測(cè)、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點(diǎn)法等方法，對(duì)照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出血清樣品中鎂離子的含量。對(duì)同一批樣品多次重復(fù)以上過程，測(cè)試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法，完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀器，測(cè)定出血漿、血清等樣品中鎂離子的含量，測(cè)試靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。而且，本發(fā)明提供的鎂離子診斷試劑盒，穩(wěn)定性好，長(zhǎng)時(shí)間存放之后仍然能夠準(zhǔn)確檢測(cè)各種類型樣品中的鎂離子含量。權(quán)利要求1.一種酶法測(cè)定鎂離子含量的方法，包括以下步驟①將待測(cè)樣品與含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，②將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動(dòng)/全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm的吸光度的下降幅度，測(cè)算出樣品中鎂離子的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法測(cè)定鎂離子含量的方法，其特征在于待測(cè)樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10～1∶500。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶法測(cè)定鎂離子含量的方法，其特征在于反應(yīng)溫度控制在20℃～50℃，反應(yīng)時(shí)間控制在2～30分鐘，檢測(cè)時(shí)設(shè)定副波長(zhǎng)在405nm以上。4.一種鎂離子診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液40～200mmol/l，甘油1～40mmol/l，腺苷三磷酸0.2～20mmol/l，還原型輔酶0.2～0.3mmol/l，甘油激酶1000～50000U/l，甘油-3-磷酸脫氫酶1000～50000U/l，穩(wěn)定劑/試劑總體積10～80％。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鎂離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液的PH范圍是6.0～11.0。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎂離子診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖液是“三羥甲基氨基甲烷～鹽酸緩沖液”、“三乙醇胺緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液”、“咪唑～鹽酸緩沖液”、“雙甘氨肽緩沖液”、“檸檬酸～檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉～鹽酸緩沖液”、“硼酸～硼砂緩沖液”、“甘氨酸～氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂～氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸緩沖液”或者“磷酸鹽緩沖液”中的至少一種。7.根據(jù)權(quán)利要求4