植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)

關(guān)于植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)

植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類并非植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。（一）、概述

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植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：

酚類化合物：黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類化合物：三萜皂甙；甾體皂甙；單萜、倍半萜、二萜含氮化合物：生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸生氰甙多炔類、有機(jī)酸第3頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。李時(shí)珍在《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。

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自然植物和細(xì)胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量（％干重）完整植物2～3年1～2植物細(xì)胞培養(yǎng)3周14第5頁,共62頁，2024年2月25日，星期天植物次生代謝產(chǎn)品的市場(chǎng)潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長(zhǎng)春花堿治療白血病18～20（美國(guó)）奎寧治療瘧疾5～10（美國(guó)）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥20～55（美國(guó)）第6頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：

從工程的角度講必須要進(jìn)一步研究和開發(fā)適宜于植物細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。從細(xì)胞生長(zhǎng)與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下3個(gè)條件：

1、培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。

2、細(xì)胞生長(zhǎng)及生物合成的速度快，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。

3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。第7頁,共62頁，2024年2月25日，星期天（二）、植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立

1、種子細(xì)胞的選擇

（1）準(zhǔn)確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類；（2）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官為外植體；

(3)高產(chǎn)種子細(xì)胞克隆的方法：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)后，將單細(xì)胞擴(kuò)增形成的愈傷組織分2份，1份成分含量分析，另1份保留培養(yǎng)。第8頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2、種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng)種子細(xì)胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從幾百毫升到幾升逐級(jí)放大。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到一定值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。第9頁,共62頁，2024年2月25日，星期天3、大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立

（1）成批培養(yǎng)：在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞或添加培養(yǎng)基后，中途不添加也不更換培養(yǎng)基的方式。

（2）連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應(yīng)器中以一定流量添加新培養(yǎng)基，同時(shí)以一定流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)基的方式。

(3)半連續(xù)培養(yǎng)：在完成成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，只保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種子細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的方式。第10頁,共62頁，2024年2月25日，星期天(三)生物反應(yīng)器類型及特點(diǎn)大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)基本原理方法與上述實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)一致，但大規(guī)模培養(yǎng)所采用的設(shè)備及控制技術(shù)比實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)要復(fù)雜的多。

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植物細(xì)胞培養(yǎng)具有周期長(zhǎng)、細(xì)胞抗剪切能力弱、易團(tuán)聚等特點(diǎn)。同時(shí)，植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，所以，植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的設(shè)計(jì)不僅要考慮有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，還要考慮有利于產(chǎn)物的積累和分離?？傮w上，適合植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器應(yīng)具有適宜的氧傳遞、良好的流動(dòng)性和較低的剪切力。第12頁,共62頁，2024年2月25日，星期天機(jī)械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器通常是在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)的，根據(jù)植物細(xì)胞的特性，其設(shè)備要求在微生物發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：攪拌裝置要減少剪切，一般改葉輪式為螺旋式；因?yàn)橹参锛?xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，需要隨時(shí)補(bǔ)充水分和營(yíng)養(yǎng)，因此必須設(shè)計(jì)加液裝置；由于植物細(xì)胞的生理活動(dòng)需要新鮮空氣，且細(xì)胞代謝也可能產(chǎn)生有害氣體，所以必須設(shè)計(jì)通氣裝置；為便于取樣觀察，一般還設(shè)計(jì)有取樣口。

第13頁,共62頁，2024年2月25日，星期天生物反應(yīng)器第14頁,共62頁，2024年2月25日，星期天StirredTankBioreactorsAnexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.Sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced(sparkling)第15頁,共62頁，2024年2月25日，星期天氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)

考慮到機(jī)械攪拌式反應(yīng)器的剪切作用難以避免，同時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)的中軸往往是容易使培養(yǎng)物污染的部位，因此，發(fā)展出空氣提升式生物反應(yīng)器，但其缺點(diǎn)是攪拌不均勻。

第16頁,共62頁，2024年2月25日，星期天BubbleColumnBioreactor

(AirliftReactor)Introductionofsterileairorpuregases

isusedbothforagitationandoxygenation第17頁,共62頁，2024年2月25日，星期天InternalLoopAirliftBioreactorTubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop

第18頁,共62頁，2024年2月25日，星期天ExternalLoopAirliftBioreactorCirculationthroughanexternalloop

第19頁,共62頁，2024年2月25日，星期天旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)

一般用于產(chǎn)品中試或某些必需裂解細(xì)胞才能獲得目的產(chǎn)物的培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是控制精確，處理靈活，缺點(diǎn)是培養(yǎng)體積較小。

第20頁,共62頁，2024年2月25日，星期天②固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：

可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而可以研究特定的代謝途徑，并便于調(diào)節(jié)；細(xì)胞位置的固定使其所處的環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物的合成；由于細(xì)胞固定在支持物上，培養(yǎng)基可以不斷更換，可以從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多的初生產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞代謝的反饋抑制，也由于細(xì)胞留在反應(yīng)器中，新的培養(yǎng)基可以再次利用這些細(xì)胞生產(chǎn)初生產(chǎn)物，從而節(jié)省了生產(chǎn)細(xì)胞所付出的時(shí)間和費(fèi)用；正是由于細(xì)胞固定在一定的介質(zhì)中，并可以從培養(yǎng)基中不斷提取產(chǎn)物，因此，它可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。第21頁,共62頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類：

包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、聚丙烯酰胺等；附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。

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1、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般程序（1）選材

應(yīng)注意以下條件：①藥效肯定；②對(duì)其有效成分有充分的了解；③有測(cè)定有效成分和藥理的可靠方法；④市場(chǎng)短缺或價(jià)格昂貴；⑤取有藥效成分的部位，且該部位較易形成愈傷組織。（四）、利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)第23頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

（2）細(xì)胞株系建立

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行分離，建立懸浮細(xì)胞繁殖體系（液體培養(yǎng)）。

在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的選擇有兩個(gè)基本要求：①有用物質(zhì)的合成積累能力強(qiáng)②生長(zhǎng)速度快

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（3）大量培養(yǎng)

將選出的優(yōu)良細(xì)胞株擴(kuò)大繁殖后，可作為細(xì)胞工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”，進(jìn)行大量培養(yǎng)。

（4）產(chǎn)品提取與純化從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中提取和純化有的產(chǎn)品。第25頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技術(shù)因素

①篩選高產(chǎn)細(xì)胞系

從實(shí)驗(yàn)材料中篩選高產(chǎn)的細(xì)胞株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。特異的次生代謝產(chǎn)物往往是特異的器官中形成的。因此，用特異器官為材料，建立特異功能的細(xì)胞系，并從中反復(fù)多代培養(yǎng)選擇有效的、高產(chǎn)的細(xì)胞株。

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篩選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因此，還需要定期檢測(cè)，更新細(xì)胞株系。第27頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

第一步：解決生物量生產(chǎn)（促進(jìn)細(xì)胞裂）；第二步：促進(jìn)次生代謝物合成，即在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)停止期前后才更換培養(yǎng)基，有利于次生物質(zhì)的積累。

②、二步培養(yǎng)法第28頁,共62頁，2024年2月25日，星期天③、培養(yǎng)基中添加前體前體：有用次生代謝物的前驅(qū)物。煙草愈傷組織培養(yǎng)中，將前體物質(zhì)—煙堿酸加入，會(huì)增加煙堿的生成量。第29頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

④、培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化與再分化，而且能影響次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。如煙草愈傷組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加IAA，能合成煙堿，而在含有2,4-D的培養(yǎng)基上，煙堿合成受阻。

第30頁,共62頁，2024年2月25日，星期天⑤、培養(yǎng)條件的影響光照、溫度等影響次生代謝。在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件使紫紅色愈傷組織能夠生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。

第31頁,共62頁，2024年2月25日，星期天⑥、采用固相細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛時(shí)，次生代謝物產(chǎn)量低。采用固相培養(yǎng)，將細(xì)胞培養(yǎng)在惰性基質(zhì)中，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，可提高次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。第32頁,共62頁，2024年2月25日，星期天思考題1．一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求？2．建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？3．懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長(zhǎng)規(guī)律？4．細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？第33頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共62頁，2024年2月25日，星期天紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus

brevifolia的樹皮中分離廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來源于紅豆杉屬植物紫杉醇簡(jiǎn)介第36頁,共62頁，2024年2月25日，星期天理化性質(zhì)英文名：Paclitaxel,Taxol?orTM分子式：C47H51NO4水溶性：0.7mg／ml穩(wěn)定性：pH4～8穩(wěn)定；pH<4較穩(wěn)定；pH>8易分解；在特定條件下紫杉醇可被氧化，但極難還原；第37頁,共62頁，2024年2月25日，星期天紫杉醇研發(fā)過程年代進(jìn)展1958NCI開始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967

發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968

從紅豆杉中分離出紫杉醇1971

完成結(jié)構(gòu)鑒定1979

發(fā)表作用機(jī)制1983

臨床Ⅰ試驗(yàn)1985

臨床II期1991

臨床III期1992

FDA批準(zhǔn)上市NCI稱其為過去15年中開發(fā)的最好的抗癌藥物20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥的三大成就之一湯姆森科技桂冠獎(jiǎng)RameshPanchagnula,InternationalJournalofPharmaceutics.1998(172)1-15.第38頁,共62頁，2024年2月25日，星期天市場(chǎng)需求抗癌一線用藥

銷售額年增長(zhǎng)率5億美元

理論需求量

2g/人,500萬人/年

1000kg/年實(shí)際銷量

350kg/年紫杉醇供需相差十分懸殊

圖1：國(guó)際紫杉醇原料藥需求走勢(shì)圖（單位：公斤）圖2：國(guó)際紫杉醇銷售額（億美元）第39頁,共62頁，2024年2月25日，星期天紫杉醇開發(fā)的關(guān)鍵問題上游產(chǎn)業(yè)——藥源問題

下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效（活性、水溶性）安全性生物相容性第40頁,共62頁，2024年2月25日，星期天藥源問題紅豆杉

主要原料植物國(guó)家一級(jí)保護(hù)野生植物，全球十大瀕危物種之一生長(zhǎng)緩慢分布有限Taxol含量低

樹皮中Taxol含量:0.00001-0.069%3000棵樹=10噸樹皮=1kgTaxol=500病人第41頁,共62頁，2024年2月25日，星期天人工栽培采用種子繁殖、扦插等無性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋找紅豆衫的替代物

從紅豆杉非樹皮部位提取產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物優(yōu)點(diǎn)：生長(zhǎng)周期縮短簡(jiǎn)便、直接缺點(diǎn)：1、紫杉醇含量低生長(zhǎng)緩慢

2、提取工藝復(fù)雜藥源問題解決辦法（一）第42頁,共62頁，2024年2月25日，星期天藥源問題解決辦法（二）化學(xué)合成全合成

1994年獲得成功現(xiàn)有六種途徑半合成以10-DABⅢ和BaccatinⅢ作為半合成原料獲得紫杉醇新方法用10-DAT缺點(diǎn)：1、合成過程煩瑣復(fù)雜，幾十步

2、費(fèi)用高，化學(xué)試劑昂貴

3、總收率太低（2%）優(yōu)點(diǎn)：1、原料枝葉含量豐富、提取相對(duì)容易，充分利用再生資源

2、產(chǎn)率高

3、最具實(shí)用價(jià)值可以工業(yè)化生產(chǎn)

4、獲取紫杉醇構(gòu)效關(guān)系信息，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造缺點(diǎn)：合成過程相對(duì)復(fù)雜（11步化學(xué)轉(zhuǎn)化和7步分離）第43頁,共62頁，2024年2月25日，星期天藥源問題解決辦法（三）生物方法組織和細(xì)胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成研究階段紅豆杉生物合成途徑基本明確

10種相關(guān)酶基因被克隆表達(dá)利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量

優(yōu)點(diǎn)：1、擺脫自然因素，可長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)

2、適應(yīng)市場(chǎng)、方便調(diào)節(jié)

3、成分簡(jiǎn)單，有利于分離純化

4、成本低、生長(zhǎng)周期短

5、為半合成提供原料

6、有望工業(yè)化生產(chǎn)缺點(diǎn)：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定

2、工業(yè)化放大研究第44頁,共62頁，2024年2月25日，星期天紫杉醇水溶性很差0.77mM/L使用增溶劑：聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇

存在問題穩(wěn)定性和水溶性較差（7mm/L）過敏反應(yīng)產(chǎn)生沉淀缺點(diǎn)：1、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定

2、工業(yè)化放大研究藥效問題第45頁,共62頁，2024年2月25日，星期天一、植物來源藥物的特點(diǎn)全世界有40%的藥物來源于植物。我國(guó)是中草藥資源最豐富的國(guó)家，有詳細(xì)記載的近5000種。中草藥治療疾病的歷史上千年，中醫(yī)藥已形成完整的科學(xué)體系。對(duì)于植物藥效成分的研究已形成“天然藥物化學(xué)”研究的新領(lǐng)域。藥用植物中具有藥物功能的物質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。除小分子的天然有機(jī)化合物以外，還有多種生物大分子活性物質(zhì)。

對(duì)不同組方的藥用成分和功能的研究是一項(xiàng)巨大的工程，相當(dāng)于基因組和蛋白質(zhì)組工程。中藥復(fù)方復(fù)雜系統(tǒng)研究（北京大學(xué)韓啟德院士）第46頁,共62頁，2024年2月25日，星期天二、植物來源藥物的種類

1、天然有機(jī)化合物（1）糖和糖苷類（2）苯丙素類：苯丙烯、苯丙酸、香豆素等（3）醌類：輔酶Q10、紫草素（4）黃酮類：黃酮醇、花色素

（5）鞣質(zhì)：奎寧酸、槲皮醇。（6）萜類：青蒿素、齊墩果酸（7）甾體：烏沙苷元、毛第黃毒苷元（8）生物堿：咖啡因、喜樹堿第47頁,共62頁，2024年2月25日，星期天2、植物蛋白質(zhì)、多肽、酶類生理活性物質(zhì)表2-163、植物糖類藥物包括單糖、聚糖和糖衍生物。表2-174、植物脂類藥物（1）脂肪和脂肪酸類：亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸（2）磷脂類：大豆磷脂（3）固醇類：豆固醇、β-谷固醇。第48頁,共62頁，2024年2月25日，星期天三、植物來源藥物的植被實(shí)例

1、植物SOD2、植酸鈣鎂與肌醇

3、植物不飽和脂肪酸四、植物藥物來源的研究前景

1、植物細(xì)胞培養(yǎng)

2、植物組織培養(yǎng)

3、有效成分的分離、純化，結(jié)構(gòu)和功能測(cè)定。第49頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共62頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共62頁，2024年2月25日，星期天

3、若干有用物質(zhì)的生產(chǎn)

①、生物堿許多生物堿已經(jīng)用作醫(yī)學(xué)上的藥物。如嗎啡等生物堿通常從鴉片中提取，用作神經(jīng)麻醉劑，利用罌粟種子的愈傷組織培養(yǎng)，可提取嗎啡堿及其它生物堿。第52頁,共62頁，2024年2月25日，星期天②、苷類物質(zhì)利用人參愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)皂苷已進(jìn)入工廠化生產(chǎn)。③、醌類物質(zhì)利用紫草、決明等愈傷組織培養(yǎng)，生產(chǎn)具有抗細(xì)菌活